一种海马蛋白酶抑制剂基因及其应用制造技术

本发明专利技术涉及一种海马蛋白酶抑制剂基因Ｈｐｉ及其编码的蛋白，以及该蛋白在制备抗菌消炎类药物中的应用。本发明专利技术用ＲＴ－ＰＣＲ的方法，从大海马总ＲＮＡ中分离得到海马蛋白酶抑制剂基因Ｈｐｉ，其ＤＮＡ序列如序列表中〈４００〉１序列所示；该基因编码的蛋白（重组海马蛋白酶抑制剂ｈｋＨＰＩ）的氨基酸序列如序列表中〈４００〉２序列所示。本发明专利技术的重组海马蛋白酶抑制剂具有抗菌作用和调节细胞生长周期作用，可用于制备治疗细菌感染所致炎症的外用药物。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种海马蛋白酶抑制剂基因Hpi及其编码的蛋白，以及该蛋白在制备抗菌消炎药物中的应用。
技术介绍
乳清酸蛋白(whey acidic protein，WAP)最初从啮齿类动物的乳汁中分离出来，由于蛋白为酸性蛋白，故而得名。之后，陆续从骆驼、兔、猪以及有袋目的负鼠，袋鼠的乳汁中发现了WAP蛋白的存在，是一种广泛存在的乳清蛋白。所有的乳清酸蛋白都含有多个半胱氨酸丰富区，每个区域有8个半胱氨酸，组成一个四对二硫键中心(four-disulfide core，4-DSC)的结构域。在这个结构域里，6个半胱氨酸的相对位置和距离是固定的，只有两个半胱氨酸的相对距离是可变的。4-DSC结构域除了半胱氨酸和一些位置保守的脯氨酸(P)、谷氨酸(G)、天东氨酸(D)和赖氨酸(K)以外，其他部分保守性很低。从database中所有已知的含有4-DSC的蛋白序列分析表明，4-DSC结构域的组成可以用以下模式表示C1-(Xn)-C2-(Xn)-C3-(X5)-C4-(X5)-C5C6-(X3-X5)-C7-(X3-X4)-C8，X表示任何氨基酸，n表示任何数量。在第一个半胱氨酸的附近，通常还有一个被称为WAP基序的保守序列，KXGXCXP。具有这样结构特征的蛋白，被称为乳清酸蛋白类蛋白，或乳清酸蛋白结构域蛋白。在所有乳清酸蛋白结构域家族的成员中，一大类是来源于乳腺的乳清酸蛋白(WAP)，另外一大类是非乳腺来源的小分子分泌蛋白，多为蛋白酶抑制剂。随着基因组测序的飞快进程和大量EST序列的提交，公共数据库里含有4-DSC结构域的非乳腺分泌蛋白越来越为人们所知。这些蛋白在各个组织里表达，多数只具有一个4-DSC结构域和一些其他的功能域，功能也非常多样，大多数具有蛋白酶抑制剂活性。目前，在人类基因组中，4-DSC结构域编码信息出现在一些不同的染色体上，其中很多编码具有蛋白酶抑制剂功能的蛋白，如，在染色体16q24上的前列腺基质蛋白20(prostatestromal protein 20，ps20)，位于X染色体上的Kallmann综合症(低促性腺激素无睾症)基因，位于染色体20q上的含有多个4-DSC结构域编码信息的基因簇，编码elafin、分泌白细胞蛋白酶抑制剂(SLPI)、副睾蛋白(HE4)以及两个尚未鉴定的蛋白序列。ps20只有一个4-DSC结构域，有生长抑制活性，对上皮细胞的增值有调节作用，被认为是一个潜在的肿瘤抑制基因。副睾蛋白HE4最初在人、狗和兔的副睾中被发现，最初被认为有蛋白酶抑制剂功能，与精子的除能相关，随着研究的深入，人们发现该基因在呼吸道、唾液腺和肾脏等组织中都有表达，在卵巢癌细胞中甚至出现过表达，是卵巢癌的标记分子。从鼠的基因组里克隆到一个在副睾和肾脏中表达的类似蛋白，据研究具有抗菌活性。研究得最深入的是SLPI和elafin，两者都是具有抗菌活性的蛋白酶抑制剂，SLPI从最初由唾液中分离出来到现在，其生物功能被广泛的揭示出来。SLPI由分泌或腺状上皮细胞表达，许多组织中都可以检测到SLPI的表达，支气管、腮腺、大小肠、皮肤、乳腺、胰腺、雌/雄性生殖道以及肾脏等等。SLPI除具有跟其蛋白酶抑制剂活性相关的抗炎、抗菌活性以外，还具有细胞增值的调控作用。Zhang等研究了SLPI对人子宫内膜上皮细胞的生长调节作用，发现SLPI能增加细胞周期因子D1的表达，而对抑制原癌基因p21ras的LOX蛋白以及IGFBP-3、TGF-β1的表达起着负调控的作用，暗示SLPI在上皮癌细胞中的高表达是导致癌细胞增值异常的原因之一。在大海马总RNA中分离发现一个编码WAP结构域家族的全新蛋白的基因，该蛋白具有3个WAP结构域家族成员特有的4-DSC结构域和WAP基序，从blast结果来看，该蛋白与从鲑鱼体腔液中分离出来的在排卵期表达量上调的排卵相关蛋白有最高的同源性(57％)，该排卵相关蛋白也属于WAP结构域蛋白家族，具有蛋白酶抑制剂活性和抗菌活性，在鲑鱼体腔液中对卵起到保护作用，推测该新基因为一个新的蛋白酶抑制剂。对该蛋白的功能进行研究能给WAP结构域家族的功能与结构域之间的关系提供新的线索和思路，并有潜力开发为抗菌消炎药物。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种新的海马蛋白酶抑制剂基因及其编码的蛋白。本专利技术的另一目的在于提供上述基因编码的蛋白在制备抗菌消炎药物中的应用。本专利技术用RT-PCR的方法，从雄海马总RNA中分离得到的海马蛋白酶抑制剂基因Hpi，其DNA序列如序列表中<400>1序列所示。上述本专利技术基因编码的蛋白(重组海马蛋白酶抑制剂，命名为hkHPI)，其氨基酸序列如序列表中<400>2序列所示；该蛋白等电点为6.55，分子量为15.4千道尔顿。该蛋白hkHPI是通过表达载体pETTRX-Hpi在大肠杆菌中以胞内可溶的形式表达的，表达量可达140mg/L。所述表达载体pETTRX-Hpi是通过将Hpi基因插入到原核融合表达载体pETTRX(中国专利申请号00124832.4)的Kpn I/Not I位点上而得到的，它是以硫氧还蛋白为融合伴体，中间插有6×His的亲和标记位点及蛋白酶EK识别位点的高效表达载体。本专利技术所选择的海马属于大海马(Hippocampus kuda Bleeker)，采自亿达洲海马养殖场。大海马cDNA文库的构建首先匀浆海马组织，提取总RNA。反转录为一链cDNA后合成双链cDNA，双链cDNA与pcDNA3.0(购自Invitrogen公司)载体连接后转化E.coli并保存每个克隆子。通过对以上重组文库克隆进行大规模随机序列测定，从中得到了1个新的编码海马蛋白酶抑制剂的克隆，命名为Hpi(其DNA序列如序列表中<400>1序列所示)。新基因编码143个氨基酸的成熟肽hkHPI(其氨基酸序列如序列表中<400>2序列所示)，等电点为6.55，分子量为15,400道尔顿，具有典型的乳清酸蛋白一级结构的特征，分子内含有23个半胱氨酸，形成11对二硫键(包含3个4对二硫键中心结构域，除第一个不完整外，C端的两个都完整)。本专利技术通过设计了一对引物，将编码海马蛋白酶抑制剂的新基因Hpi用PCR方法从pcDNA3.0载体上扩增出来，克隆到原核融合表达载体pETTRX上，构建成表达质粒pETTRX-Hpi，并将其转化大肠杆菌BL21(DE3)。此表达载体(pETTRX-Hpi)以T7为启动子，采用分子伴侣TRX为融合伴体，帮助重组蛋白正确折叠，以可溶的形式表达，TRX的C端有柔链区和6×His结构，便于利用固定化金属配体亲和层析进行纯化。所设计的上游引物含有蛋白酶EK位点，以便外源蛋白单体的获得。通过对培养时间，诱导时间，温度等条件的摸索和优化，hkHPI融合蛋白的表达量可达到140mg/L，并且基本上完全处于可溶状态。本专利技术还摸索和优化了重组hkHPI蛋白的纯化条件，表达产物的超声裂解液经Ni2+Chelating Sepharose亲和色谱层析，得到纯度较高的融合蛋白，融合蛋白经EK蛋白酶切割和进一步的S100凝胶柱层析，可得到纯度在85％以上的成熟重组海马蛋白酶抑制剂蛋白本文档来自技高网...

【技术保护点】
用ＲＴ－ＰＣＲ的方法从海马总ＲＮＡ中分离得到的海马蛋白酶抑制剂基因Ｈｐｉ，其ＤＮＡ序列如序列表中〈４００〉１序列所示。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：徐安龙，孙孜孜，张宁，廖剑，董美玲，
申请(专利权)人：中山大学，
类型：发明
国别省市：81[中国|广州]