重组禽痘病毒制造技术

本发明专利技术涉及重组禽痘病毒（ＦＷＰＶ）和包含用于这种重组禽痘病毒的基因序列的ＤＮＡ载体。本发明专利技术还涉及包含所述重组禽痘病毒或ＤＮＡ载体的药用组合物、所述重组禽痘病毒治疗传染病或肿瘤疾病的用途，以及产生所述重组禽痘病毒或ＤＮＡ载体的方法。本发明专利技术还涉及包含重组ＤＮＡ载体或重组禽痘病毒的真核细胞或原核细胞。本发明专利技术基于鉴定到ＦＷＰＶ－Ｆ１１Ｌ基因是外源ＤＮＡ的新的插入位点。（*该技术在2023年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及重组禽痘病毒以及包含用于重组禽痘病毒的基因序列的DNA载体。另外，本专利技术涉及包含重组禽痘病毒或DNA载体的药用组合物，重组禽痘病毒用于治疗传染病或肿瘤疾病的用途，以及制备重组禽痘病毒或DNA载体的方法。最后，本专利技术涉及包含重组DNA载体或重组禽痘病毒的真核细胞或原核细胞。
技术介绍
不同种属的痘病毒已经确认为重组疫苗载体(Moss，1996；Paoletti，1996)。已知包括原型成员禽痘病毒(FWPV)的禽类痘病毒仅在禽类细胞中复制。在哺乳动物中，病毒繁殖被阻断在复制周期的不同时期，这取决于细胞类型，但是也存在有病毒特异性的受控基因表达(Taylor et al.，1988；Somogyi et al.，1993)。利用该特征来开发重组的候选禽类痘病毒，作为接种哺乳动物包括人类的、对抗传染病和癌症的安全而不复制的载体(Wang et al.，1995；Perkus et al.，1995；Roth et al.，1996)。这些疫苗中有些已处于I期临床试验(Cadoz et al.，1992；Marshall et al.，1999；Berencsiet al.，2001)或II期临床试验(Belshe et al.，2001)。另外，更复杂的接种策略可能需要不同抗原的同时表达或者抗原和免疫共刺激分子组合表达(Leong et al.，1994；Hodge et al.，1999)。这些基因可以以单一序列盒的形式插入到病毒基因组的一个位点中，或者连续插入，使得构建的载体病毒可以连续地改进。在后一情况下，需要在不同稳定插入位点中进行选择，并能够消除选择标记，以便对于向不同位点的插入来说可以重复相同的选择策略。另外，对于人用疫苗来说不能存在标记基因。通过鸟枪插入策略已经在FWPV基因组中鉴定到了数个插入位点(Taylor et al.，1988；Jenkins et al.，1991)。另外，外源基因的插入已经将病毒基因组靶向导入末端反向重复区中(Boursnell et al.，1990)，靶向到非必需基因如胸苷激酶基因(Boyle & Coupar，1988)，或靶向到编码基因序列之间的区域(Spehner et al.，1990)。已经描述了用于产生重组病毒的几个策略，其中，用于噬斑分离的标记基因在使用后缺失。第一个策略是Falkner和Moss(1990)所述、广泛使用的优势选择法，其中选择标记存在于插入序列盒外部的质粒序列中。通过单交换事件产生的、包含全部质粒序列的重组病毒在选择培养基存在的条件下获得。由于旁侧区域重复序列的存在，这些重组病毒不稳定。在不存在选择培养基的条件下，位于这些重复序列之间的标记基因在第二次重组后缺失，产生野生型(wt)病毒或稳定的重组病毒。后者必须根据噬斑法再次分离，并通过PCR或Southern印迹法鉴定。第二种方法基于一个发现在表达位于正向重复取向的P7.5启动子控制之下的靶蛋白和β-半乳糖苷酶的重组FWPV中，在启动子重复之间发生同源重组，导致lacZ基因的缺失(Spehner et al.，1990)。由于这一原因，丢失标记基因的重组病毒形成白色噬斑。还建立了类似的策略，使用调控型痘苗病毒K1L基因作为瞬时选择标记产生重组MVA病毒，所述痘苗病毒K1L基因通过基因组内同源重组方法消除(Staib etal.，2000)。FWPV比痘苗病毒生长缓慢。对于强FWPV接种病毒的生成和使用来说，维持重组病毒的完全复制能力是非常重要的。和现有的载体相比，本专利技术基于一个目的，即提供重组禽痘病毒，使载体在插入外源DNA后稳定性增加，并且用作疫苗载体时更为安全，同时在选择重组病毒过程中保留完全复制能力和最佳效力。这些目的已经达到，参考各项独立权利要求。在从属权利要求中描述了本专利技术的优选实施方案。根据本专利技术的解决方案基于鉴定到FWPV-F11L基因是外源DNA的新的插入位点。F11L突变的病毒在感染CEF(鸡胚成纤维细胞)之后有效复制。研究表明，使用能够使标记基因瞬时表达的F11L载体质粒，能够快速产生重组FWPV病毒，其稳定生成肿瘤模式抗原酪氨酸酶。FWPV的F11L基因本身是公知的，已经得以精确地鉴定。在Afonso et al.，2000的出版物中，F11L基因同源物精确地鉴定为ORF FPV110，基因组位置为131.387-132.739。但是Afonso等没有公开F11L基因作为外源DNA整合位点的特征。使用F11L基因作为外源DNA的整合位点提供几个意想不到的优点首先，令人惊奇地发现在F11L基因中包含一个或多个外源DNA插入物的重组禽痘病毒和传统的载体相比具有更高的载体稳定性。其次，根据本专利技术的FWPV已证实在体内用作疫苗载体时非常安全。根据本专利技术插入F11L基因的另一个优点是插入可以在基因的任意位点进行。根据本专利技术的基本想法，结果提供了在F11L基因中包含至少一个外源DNA插入物的重组禽痘病毒(FWPV)。如上所述，插入在FWPV基因组的位置131.387-132.739进行。虽然插入基本上可以在F11L基因的任意位置进行，往禽痘病毒基因组中限定为核苷酸位置131.387-132.739的基因组区域插入是优选的。在本专利技术的上下文中，外源DNA通常指通过基因工程手段导入生物有机体、细胞或病毒等DNA中而不能从这些DNA中获得的任意DNA。根据一个优选实施方案，外源DNA包含至少一个外源基因，任选地与调控外源基因的表达序列组合。本专利技术中重组禽痘病毒(FWPV)包含的外源基因编码多肽，优选治疗用多肽；和/或编码可检测标记和/或是可选择基因。本文所用的报道基因指基因产物可通过简单的生化手段或组织化学方法得以检测的基因。术语报道基因的同义词是指示基因或标记基因。在本专利技术的上下文中，可选择基因或可选择标记分别指分别用于病毒或细胞的基因，其中各自的基因产物分别产生相对于不合成各基因产物的病毒或细胞来说的生长优势或存活优势。优选使用的选择标记是大肠杆菌(E.coli)鸟嘌呤磷酸核糖转移酶、大肠杆菌潮霉素抗性和新霉素抗性的基因。举例来说，外源DNA序列可以是分别编码病原性试剂或病原性试剂组分的基因。病原性试剂指能够导致疾病的病毒、细菌或寄生虫，还指在生物有机体中表现为不受控生长从而导致致病性生长的肿瘤细胞。这些病原性试剂的实例描述在Davis，B.D.et al中(Microbiology，第3版，Harper International Edition)。优选的病原性试剂是流感病毒或风疹病毒或呼吸道合胞体病毒、Dengue病毒、人免疫缺陷病毒如HIVI和HIVII、人肝炎病毒如HCV和HBV、疱疹病毒、乳突淋瘤病毒、疟疾恶性疟原虫和导致肺结核的分支杆菌的组分。举例来说，病原性试剂的特定实例可以是病毒的包膜蛋白(HIV Env、HCVE1/E2、流感病毒HA-NA、RSV F-G)、调控性病毒蛋白(HIV Tat-Rev-Nef、HCVNS3-NS4-NS5)、炭疽芽孢杆菌的保护性抗原蛋白、裂殖虫表面抗原、恶性疟原虫的环子孢子蛋白、作为黑素瘤抗原的酪氨酸酶蛋白或作为人类腺癌抗原的HER-2/neu蛋白。编码肿瘤相关抗原的优选基因编本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种重组禽痘病毒（ＦＷＰＶ），在Ｆ１１Ｌ基因中包含至少一个外源ＤＮＡ插入物。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：罗伯特贝尔，丹尼丝布兰格，福尔克尔埃尔费，格尔德祖特尔，
申请(专利权)人：GSF环境与健康研究中心有限公司，
类型：发明
国别省市：DE[德国]