一种具有防治Ⅰ型糖尿病作用的重组门冬酰胺酶制造技术

本发明专利技术提供了一种能用于预防和治疗Ⅰ型糖尿病的重组门冬酰胺酶，通过基因操作，将Ⅰ型糖尿病特异的一段抗原表位Ｐ２７７和源于破伤风毒素的Ｔ辅助表位肽段融合到门冬酰氨酶的Ｃ端，形成一种新的重组蛋白和相应编码基因。该基因在大肠杆菌中高效表达，生成的重组酶能分泌到周质中并保持大部分酶活性，并能通过渗透振扰法快速制备。重组酶将Ｐ２７７多肽呈现到了酶表面，能够诱发机体产生抗Ｐ２７７多肽的特异抗体，增强Ｐ２７７的免疫原性，极大地提高了Ｐ２７７预防Ⅰ型糖尿病的作用。

【技术实现步骤摘要】

在医学领域中，本专利技术是一种重组蛋白，能用于预防和治疗I型糖尿病的发生。
技术介绍
大肠杆菌L-门冬酰胺酶是一种临床上广泛使用的抗白血病药物，本实验室已从大肠杆菌野生株中克隆了该酶基因，工程菌表达的酶蛋白占菌体总蛋白的48％以上，建立了相应的渗透振扰提取新工艺，能以高收率提取获得高纯度重组蛋白。在研究中我们注意到，当门冬酰胺酶基因的C末端区连接上破伤风毒素830-854肽段基因后，再在下游接加适当长度的多肽编码序列时，所表达的融合蛋白可以分泌到细菌周质腔，并能形成有门冬酰氨酶活性的重组分子，这表明融合的多肽并没有改变或轻微改变了酶分子的天然构象，换而言之，连接的多肽可能仅游离于酶分子的表面，具有相对的独立性。门冬酰胺酶作为有效表位载体有许多优点(1)门冬酰胺酶活力测定的灵敏度高，如果呈现构象化表位的酶依然具有活力，这相当于构象化多肽已被酶标记，并且不影响多肽与抗体的结合活性；(2)门冬酰胺酶由四个相同亚基构成，因此一个酶分子上呈现有四个环状多肽，能方便地设计“夹心法”等酶免疫测定方法。(3)我们在门冬酰胺酶PAGE电泳时还发现该酶有形成多聚分子的倾向，能形成二聚体、三聚体和四聚体蛋白，这种颗粒化倾向有利于增强免疫原性。该酶在临床应用中已经显示有很强的免疫原性，能用于发展疫苗；(4)门冬酰胺酶是血中半衰期较长的药物。若肌肉注射也能缓慢吸收。有足够时间供抗原充分发挥免疫刺激作用；(5)门冬酰胺酶也有一个二硫键，能分泌到细胞周质腔(periplasm)折叠，在周质腔氧化环境中二硫键容易自发形成。(6)将抗原多肽通过T细胞表位肽段与门冬酰胺酶C端融合，在细菌中高效表达并分泌到细胞周质腔中，这种基因工程菌在周质腔中含大量表面呈现有抗原多肽的重组门冬酰氨酶，能够直接用于发展活菌苗或灭活菌苗。(7)门冬酰氨酶已经在临床上用于治疗白血病和淋巴瘤，其安全性已经得到验证，用该酶作为呈现载体，开发用于人体的药物，将是较为安全的。抗热休克蛋白60((heat shock protein 60，HSP60)是人I型糖尿病，或称胰岛素依赖型糖尿病(insulin-dependent diabetes mellitus，IDDM)中极其重要的一个抗原，P277多肽是存在于人HSP60蛋白上437-460的一段特异性多肽，是在IDDM中发挥作用的特异片段，序列为VLGGGVALLRVIPALDSLTPANED。有文献报道了一次随机的、双盲的二期临床实验，实验结果表明，P277能挽救机体内未受损的胰岛β细胞的功能(即使机体已表现出明显的临床症状)，使其能继续释放内源性的胰岛素。在鼠和人中，与胰岛β细胞决定簇作用的主要为CD4+T细胞，而CD4+T细胞按其分泌的细胞因子不同又分为Th1细胞和Th2细胞。Th1细胞主要分泌IL-2和IFN-γ，前者能有效刺激T细胞增值，后者为炎症因子，能引起阻止发炎并诱导B细胞产生IgG2α抗体。而且由于77％的Th1细胞具有细胞毒作用，它可以溶解呈递自身移植抗原的β细胞，从而使抗体生成降低，降低体液免疫。Th2细胞分泌IL-2和IL-10，能降低Th1效应。IL-4促进β细胞产生IgG1抗体，抑制Th1产生前炎症因子。IL-10通过影响抗原呈递细胞和巨噬细胞释放前炎症因子而抑制Th1活性。P277可以作用于T细胞，诱使Th1向Th2细胞类型的转化，至于P277为什么能诱导这种变化，现在认为关键在于P277本身的抗原特性，结构等，因为T细胞表型的分化受不同抗原刺激产生不同的结果。因此可考虑用此作为免疫疫苗来预防和治疗I型糖尿病。疫苗的方法可以克服传统的口服或注射胰岛素及器官移植等方法的诸多缺点，更重要的是它能挽救未损伤的β细胞，使其继续释放内源性的胰岛素。由于线性多肽构象不稳定、免疫原性较弱，常不能激发有效的保护性免疫，这是多肽疫苗研究中常遇到的老问题。虽然人们也常用戊二醛等双功能试剂将多肽聚合，或用化学方法将肽与载体偶联来弥补多肽免疫原性较弱的不足、有时也通过在肽两端引入半胱氨酸使多肽通过二硫桥环化的方法来保持肽的特定构象，然而常常不能同时兼顾两方面的问题。通过基因工程法将四个拷贝的多肽呈现到一个酶分子表面，有望使多肽能激发机体产生抗多肽特异性免疫反应。
技术实现思路
本专利技术的一个目的是提供一种呈现P277肽段的重组门冬酰氨酶基因和蛋白质。本专利技术的再一目的是提供生产该该重组蛋白的方法。本专利技术的还有一个目的是该重组门冬酰氨酶的用途。本专利技术的第一方面，提供了一种呈现多肽P277的重组门冬酰氨酶基因和蛋白。该基因序列编码具有图1所示氨基酸序列的重组蛋白质，该蛋白质的DNA序列包括图1中第1-1218位核苷酸序列。应用基因操作技术将具有强T辅助表位功能的破伤风毒素830-854多肽(QYIKANSKFIGITELIYSYFPSVI，简称TTP)、作为连接肽的Ser-Ser-Gly-Thr肽段和作为呈现肽段的P277连接到门冬酰氨酶的C末端，在大肠杆菌中表达出有活性的融合蛋白，具体步骤是(1)用聚合酶链反应(PCR)从大肠杆菌染色体DNA中扩增获得门冬酰氨酶II基因，在大肠杆菌中高效表达；(2)用基因工程方法将具有强T辅助表位功能的破伤风毒素830-854多肽(QYIKANSKFIGITELIYSYFPSVI，以下简称TTP)、作为连接肽的Ser-Ser-Gly-Thr肽段和P277肽段(VLGGGVALLRVIPALDSLTPANED)连接到门冬酰氨酶的C末端，在大肠杆菌中表达出有活性的融合蛋白；这样，P277肽段就被呈现到了酶的表面，由于门冬酰氨酶是同性四聚体蛋白，因此，每个酶分子表面呈现有四个同形的多肽。通过测定酶活力，能够观察到这种新的呈现有P277多肽的重组蛋白在大肠杆菌中表达并分泌到细菌细胞的周质腔中，用渗透振扰法也很容易从周质腔中分离出具有门冬酰氨酶活性的重组酶。本专利技术所述的重组酶基因适宜在大肠杆菌中表达，将基因引入其他生物体，如肠道习居的各种微生物、各种减毒的病原菌，同样能表达出相同功能的重组酶。在本专利技术的第二方面，是提供生产该抗人I型糖尿病重组蛋白的方法，其技术路线详述如下1.P277基因的设计与获得P277是人HSP60上的一段437VLGGGVALLRVIPALDSLTPANED460，该序列是在HSP60中对IDDM发挥作用的特异片段。我们将442和447位的C(半胱氨酸)用V(缬氨酸)来置换，以增强肽段的稳定性，两者具有相同的免疫特性。根据多肽P277氨基酸序列，选择原核和真核生物均适用的密码子，借助于计算机设计两条寡核苷酸链，分别作为上游、下游引物，并在上游引物5’端加上限制性核酸内切酶BamHI的酶切位点，下游引物5’端加上终止密码子和限制性核酸内切酶HindIII的酶切位点，两条引物互补序列为20个碱基，通过聚合酶链式反应(PCR)法获得P277多肽基因的核苷酸序列。2.门冬酰胺酶-TTP基因的设计与获得在门冬酰胺酶-TTP碱基序列的前提下，借助于计算机设计两条寡核苷酸链，以本实验室已构建的pET28-AnsB-TTP质粒为模板，5’端添加了NcoI的识别位点，3’端添加了BclI的识别位点，通过PCR方法获得AnsB-TTP的核苷酸序列。3.pET28-P277重组基本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种人工构建的呈现有Ｐ２７７肽段具有预防人Ⅰ型糖尿病作用的门冬酰氨酶，其特征在于通过基因操作将Ｐ２７７肽段通过一段间隔肽和源于破伤风毒素的Ｔ辅助表位肽段，连接在Ｌ－门冬酰氨酶的Ｃ端；形成的融合基因可以表达产生具有门冬酰氨酶活性的融合蛋白，Ｐ２７７多肽被呈现到酶表面，不影响酶自身的折叠。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：刘景晶，朱爱华，刘文涛，李文佳，吴洁，曹荣月，
申请(专利权)人：中国药科大学，
类型：发明
国别省市：84[中国|南京]