一种碱性低温蛋白酶及其制备方法技术

一种碱性低温蛋白酶及其制备方法，涉及一种细菌和从细菌得到的蛋白酶。提供一种从南极深海泥样获得并经分离成为纯培养物的菌株海杆菌属Ｒ２、从Ｒ２菌株得到的碱性低温蛋白酶及其制备方法。保藏编号为ＣＣＴＣＣＮＯ：Ｍ２０５００２。其步骤为粗酶液制备：将菌株Ｒ２活化后接于培养基，培养至指数生长期，再转接于培养基中，加氨苄青霉素和天冬酰胺，培养，发酵，离心；粗酶液加硫酸铵离心取上清，离心取沉淀，在缓冲液中透析；酶液离心，冷冻干燥，再上样洗脱，收集酶活性部分冷冻干燥；重溶于缓冲液中并透析，上样洗脱，合并活性部分，冷冻干燥；样品溶于缓冲液中并透析分离纯化，收集有活力部分冷冻干燥，即为纯酶。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种细菌和从细菌得到的蛋白酶，尤其是涉及一种从海杆菌属(Marinobactersp.)R2菌株和从该细菌得到的碱性低温蛋白酶及其制备方法。
技术介绍
已有的碱性蛋白酶可从多种途径获得，其中由微生物获得碱性蛋白酶以及碱性蛋白酶在洗涤剂等行业的应用已有一些报道，例如1913年Rohm首先将胰岛蛋白酶用于洗涤浸泡剂，1945年Dr.Jaag(瑞士)等发现了微生物碱性蛋白酶。而用于洗涤剂的碱性蛋白酶商品也越来越多，例如美国GENENCOR国际公司的Properase CT，丹麦NOVO公司的Savinase 4.OT碱性低温蛋白酶等。公告号为CN1109750C的专利提供一种新型碱性低温蛋白酶、制造方法、应用和产生该蛋白酶的微生物，涉及一种新的黄杆菌属未知种菌株YS9412-130，由该菌株或其突变体产生的新型碱性低温蛋白酶，该蛋白酶在低温条件下具有低活化能和高活性比，能有效降解蛋白类；酶基因编码由792个核苷酸组成，与丝氨酸蛋白酶有不同程度的同源性，但不同于已有丝氨酸蛋白酶家族，属一种新生型丝氨酸蛋白酶家族。
技术实现思路
本专利技术旨在提供一种从南极深海泥样获得并经分离成为纯培养物的菌株海杆菌属(Marinobacter sp.)R2。本专利技术的另一目的在于提供一种从海杆菌属R2菌株得到的碱性低温蛋白酶及其制备方法。本专利技术所说的菌株海杆菌属(Marinobacter sp.)R2于2005年1月5日保藏于中国武汉的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NOM205002。样品的来源为南极深海900米深处的泥样。菌株的筛选分离和培养方法为将泥样用灭菌海水按10、100、1000的稀释倍数稀释后，涂布于筛选培养基，于20℃培养一周，挑选出具有透明圈的单菌落，进一步划线分离，取单菌落镜检为纯种后于-70℃超低温冰箱中保藏。所说的培养基如下1、改良的2216E培养基蛋白胨0.5％，酵母膏0.1％，自然陈海水，pH7～8。2、MM培养基(NH4)2SO40.1％，K2HPO40.7％，KH2PO40.3％，柠檬酸钠0.05％，MgSO40.01％，葡萄糖0.5％，琼脂1.5％～2.0％，蒸馏水配制。3、酪蛋白培养基KH2PO40.04％，Na2HPO40.1％，NaCl 0.01％，ZnSO40.002％，CaCl20.0002％，酪素0.4％，酪素水解氨基酸0.005％，琼脂1.5％～2.0％，蒸馏水，pH7.0～7.2。4、筛选培养基脱脂奶粉1％，酵母膏0.2％，琼脂粉1.5％，自然陈海水，pH7～8。5、发酵培养基酪蛋白1％，酵母膏0.2％，KH2PO40.04％，Na2HPO40.1％，ZnSO40.002％，CaCl20.0002％，自然陈海水，pH7～8。菌株海杆菌属R2经下列方法鉴定后属于海杆菌属(Marinobacter sp.)的一个新种。1、16S rDNA序列分析结果表明R2菌株属于海杆菌属(Marinobacter sp.)。2、DNA-DNA杂交实验结果显示，菌株R2的基因组DNA与Marinobacterhydrocarbonoclasticus同源性仅为70％。3、形态学特征及抗性试验油镜下观察，R2细胞呈杆状，单个排列。革兰氏染色为阴性，菌体大小为10～15μm×2～3μm。菌落呈圆形，表面粗糙无光泽，边缘隆起，有明显的皱褶，颜色为乳白色，不透明。在酪蛋白培养基平皿上可产生明显的透明圈。抗生素抗性实验表明R2菌株对氨苄青霉素、卡那霉素和链霉素均具有抗性。本专利技术所说的菌株海杆菌属R2碱性低温蛋白酶具有以下酶学性质1、菌株海杆菌属R2碱性低温蛋白酶的最适反应温度为20℃，在15～25℃范围内酶活力高，表现出明显的低温蛋白酶特性。菌株海杆菌属R2碱性低温蛋白酶在0～20℃内活力较为稳定，30℃下保温24h后酶活降为8.3％，40℃保温1h后酶活剩余7.6％，50℃以上10min基本丧失全部活力，符合低温蛋白酶对热敏感的特性。Ca2+在一定程度上提高了酶的稳定性。2、菌株海杆菌属R2碱性低温蛋白酶的最适pH为9～10，属于碱性蛋白酶。3、菌株海杆菌属R2碱性低温蛋白酶能够降解胰凝乳蛋白酶的特异性底物N-Succ-(Ala)2-Pro-Phe-pNA和N-Succ-(Ala)2-Pro-Leu-pNA，具有类胰凝乳蛋白酶活性。4、螯合剂EDTA和丝氨酸蛋白酶专一抑制剂Phenylmethylsufonyl fluoride(PMSF)、4-(2-Aminoethyl)benzenesulfonyl fluoride(AEBSF)对菌株海杆菌属R2碱性低温蛋白酶显示出较强的抑制作用，而半胱氨酸蛋白酶专一抑制剂E-64和天冬氨酸蛋白酶专一抑制剂pepstatinA对此酶均无抑制作用。表明菌株海杆菌属R2碱性低温蛋白酶属于丝氨酸蛋白酶。5、高浓度的变性剂，包括十二烷基硫酸钠(SDS)，尿素，盐酸胍，二巯基丁二醇(DTT)，巯基乙醇对菌株海杆菌属R2碱性低温蛋白酶均有较为明显的抑制作用。6、Ca2+、Mn2+、Cu2+对菌株海杆菌属R2碱性低温蛋白酶有较为明显的激活作用，而Cd2+、Co2+则能抑制酶活。本专利技术所说的菌株海杆菌属R2碱性低温蛋白酶的制备方法步骤为1)粗酶液制备将菌株R2用无机盐培养基进行活化后转接于液体酪蛋白培养基中，在5～30℃的条件下振荡培养至指数生长期，将处于指数生长期的菌液转接于液体发酵培养基中，在液体发酵培养基中加入氨苄青霉素，在5～25℃温度下振荡培养，1～4天后加入天冬酰胺，继续振荡培养至培养基中的固体酪蛋白颗粒消失且培养液呈淡乳黄色即为产酶高峰期，将发酵液离心，取上清，得粗酶液；2)粗酶液加硫酸铵至30％～40％饱和度，离心取上清，继续加硫酸铵至70％～80％饱和度，离心取沉淀，在Tris-HCl缓冲液中透析过夜；3)将透析过后的酶液离心，上清液用冷冻干燥进行浓缩，再上样于已用Tris-HCl缓冲液预平衡过的DEAE-52柱，洗脱，收集酶活性部分冷冻干燥；4)把冷冻干燥后的酶粉重溶于Tris-HCl缓冲液中并透析过夜，然后上样于用同一缓冲液平衡的Sephadex G-75柱，并用相同的缓冲液洗脱，合并活性部分，冷冻干燥；5)将冻干后的样品溶于Tris-HCl缓冲液中并透析过夜，再分离纯化，收集有活力部分冷冻干燥，即为纯酶。在步骤1)中，活化菌种时的无机盐培养基选自MM培养基(NH4)2SO40.1％，K2HPO40.7％，KH2PO40.3％，柠檬酸钠0.05％，MgSO40.01％，葡萄糖0.5％，琼脂1.5％～2.0％，蒸馏水配制。发酵时加入氨苄青霉素终浓度为0.05％，天冬酰胺的终浓度为0.005％。在步骤3)中，所说的洗脱采用含0～2mol/LNaCl线性梯度的Tris-HCl缓冲液洗脱。在步骤5)中，所说的分离纯化时所用的缓冲液采用0.01mol/L Tris-HCl缓冲液，pH8.0～9.0。所说的分离纯化采用电泳纯化，电泳纯化的条件为分离胶浓度14％，柱高5cm，电压300V；浓缩胶浓度为4％，柱高1cm，电压240V。蛋白酶活力测定采用Folin酚试剂显色法进行。菌株海杆菌属R2所产碱性低温蛋白酶的特性及优点是1、R2菌株所产本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种菌株海杆菌属（Ｍａｒｉｎｏｂａｃｔｅｒｓｐ．）Ｒ２，２００５年１月５日保藏于中国武汉的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为ＣＣＴＣＣＮＯ：Ｍ２０５００２。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：曾润颖，林念炜，
申请(专利权)人：国家海洋局第三海洋研究所，
类型：发明
国别省市：92[中国|厦门]