一种建立多能人胚泡衍生的干细胞的方法技术

本发明专利技术涉及一种用于建立多能人胚泡衍生的干细胞（ＢＳ）细胞系的方法，所述方法获得的干细胞，所述细胞向分化细胞的分化，分化的细胞，以及所述分化的细胞在制备药物中的用途。可将分化的多能干细胞分化成多种特化的细胞类型，其可用于制备治疗如下病症或病情，所述病症或病情涉及组织退化（例如胰腺退化导致例如糖尿病的形成）或ＣＮＳ退化（阿尔茨海默症、帕金森氏症等）或由例如中风或物理创伤引起的中枢神经系统退化。（*该技术在2022年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种用于建立多能人胚泡衍生的干细胞(BS)细胞系的方法，所述方法获得的干细胞，所述细胞向分化细胞的分化，分化的细胞，以及所述分化的细胞在制备药物中的用途。可将未分化的多能干细胞分化成多种特化的细胞类型，其可用于制备治疗如下病症或病情的药物，所述病症或病情涉及组织退化(例如胰腺退化导致例如糖尿病的形成)或CNS退化(例如阿尔茨海默症、帕金森氏症等)或由例如中风或物理创伤引起的中枢神经系统退化。
技术介绍
干细胞是具有独特能力的一种细胞类型，其能自我更新，且可以形成特化或分化的细胞。尽管大多数机体的细胞，如心脏细胞或皮肤细胞被委以执行特定功能，干细胞是未被委派的，直到其接受形成一种特化细胞类型的信号。干细胞的独特之处在于其繁殖能力，以及其可变为特化型的能力。多年来，研究人员一直致力于寻找使用干细胞替代受损或患病的细胞和组织的途径。目前，多数研究集中在两类干细胞上胚胎干细胞和体干细胞。胚胎干细胞衍生自预植入的受精卵母细胞，即胚泡，而体干细胞存在于成体器官如骨髓、表皮和肠中。多能性测试显示胚胎或胚泡衍生的干细胞(以下称为胚泡衍生的干细胞或BS细胞)可形成器官中的所有细胞(包括生殖细胞)，体干细胞则只具有有限的能力以形成后代细胞类型。1998年，研究人员首次能够从人受精卵母细胞中分离BS细胞，且将其在培养基中生长(见如美国专利5,843,780和6,200,806)。在上述专利说明书中所使用的方法依赖于使用带有完整透明带的胚泡。此外，在所述专利中公开的方法特别使用了内细胞团细胞，其业已经免疫切除法分离以置于小鼠胚胎饲养细胞上。该方法具有多种缺陷，例如，其费时，技术上困难且干细胞产率低。总之，上述缺陷使所述方法为昂贵的方法。目前，只有两篇关于hBS细胞的建立和表征的文章发表，数目之低显示了与从人胚泡建立这些干细胞相关的许多意想不到的困难。结果，仅可得非常少的hBS细胞系。本专利技术描述了一种制备hBS细胞系的方法，以及一系列独立的方法步骤的组合，所述方法步骤单独不足以衍生hBS细胞，但一起使用时，它们构成了hBS细胞之成功衍生的最低要求。此外，本专利技术还允许由孵化的和完整的胚泡成功衍生hBS干细胞，以及在将胚泡种板于饲养细胞上后hBS细胞系的衍生。前述已有方法的困难之一在于实现胚泡在饲养细胞上的高效附着。这导致了终产物细胞的低产率。本专利技术克服了上述困难。也许，hBS细胞力所能及的潜在应用是产生可用于所谓细胞治疗的细胞和组织。许多疾病和紊乱源自细胞功能的破坏或机体组织的结构丧失。今天，捐赠的器官和组织经常用于替换生病或受损的组织。然而，患有适于通过上述方法治疗的疾病的人数远远超过可供移值的器官数。hBS细胞的可得性以及引导所述细胞形成不同细胞(如产胰岛素β-细胞，心肌细胞和产多巴胺神经元)的命运之有效方法的大力研究，为将来在退化性疾病(如糖尿病、心肌梗塞和帕金森氏症)的基于细胞的治疗上的应用提供了日益增长的可能性。专利技术描述本专利技术人建立了用于从受精卵母细胞建立多能人胚泡衍生的干细胞系的方法，包括在未分化状态中细胞系的增殖。因此，本专利技术涉及一种获得多能人胚泡衍生的干细胞系的方法，包括步骤i)利用任选的具有1级或2级的受精的卵母细胞，以获得任选的具有A级或B级的胚泡；ii)将胚泡与饲养细胞共培养，以建立内细胞团细胞的一个或多个集落；iii)通过机械切开分离内细胞团细胞；iv)将内细胞团细胞与饲养细胞共培养，以获得胚泡衍生的干细胞系；v)任选的，扩增胚泡衍生的干细胞系。由上述，本专利技术的一个目的为提供一种建立未分化的人胚泡衍生的干细胞系的方法。作为此方法的起始材料，使用受精的卵母细胞。受精卵母细胞的质量对所得胚泡的质量很重要。在本专利技术的方法中，按如下方法进行胚泡的建立和评估。在方法步骤i)中，人胚泡可衍生自冷冻或新鲜的人体外受精卵母细胞。下面描述了筛选用于本专利技术方法中的合适卵母细胞的步骤。本专利技术人发现本方法之重要的成功标准是卵母细胞的正确选择。因此，如果仅应用3级卵母细胞，获得满足一般性要求(见下述)的hBS细胞系的可能性就低。捐献的新鲜受精卵细胞于第0日将卵母细胞在Asp-100(Vitrolife)中抽吸，在第1日于IVF-50(Vitro life)中受精。基于第3日的形态和细胞分裂评估受精的卵母细胞。下表用于受精卵母细胞的评估1级受精卵母细胞均为卵裂球，无碎片；2级受精卵母细胞＜20％的碎片；3级受精卵母细胞＞20％的碎片。于第3日评估后，受精的1级和2级卵母细胞或植入或冷冻贮存。受精的3级卵母细胞移入ICM-2(Vitrolife)。进一步将受精的卵母细胞培养3-5天(即，受精后5-7天)。按下表评估胚泡A级胚泡扩增，于第6日带有独立的内细胞团(ICM)，B级胚泡不扩增，但其它方面类似于A级，C级胚泡无可见ICM。捐赠的冷冻受精卵母细胞；于第2日(受精后)受精卵母细胞于4细胞期利用Freeze-kit(Vitrolife)冷冻。在液氮中贮存冷冻的受精卵母细胞。在5年限期满前取得捐赠人的知情同意。利用Thaw-kit(Vitrolife)融化受精的卵母细胞，自第2天起按照上述步骤操作。如前述，新鲜的受精细胞来自3级质量，而冷冻的受精卵母细胞来自1级和2级，依本专利技术方法所得的数据，发育成胚泡的新鲜受精卵母细胞的百分比为19％，而50％的冷冻受精卵母细胞发育成胚泡。这意味着冷冻的受精卵母细胞对于获得胚泡而言更好，这可能是由于受精卵母细胞的质量更高。衍生自新鲜的受精卵母细胞的胚泡中11％发育成干细胞系，而衍生自冷冻的受精卵母细胞的胚泡中15％发育成干细胞系。总之，在经培养的受精卵母细胞中，2％的新鲜受精卵母细胞发育成干细胞系，7％的冷冻受精卵母细胞发育成干细胞系。受精卵母细胞至胚泡阶段的培养之进行参照本领域周知的方法。用于制备胚泡的方法参见Gardner等人，Embryo culture systems，InTrounson，A.O.和Gardner，D.K.(编)，Handbook of in vitro fertilization，第二版，CRC Press，Boca Raton，pp.205-264；Gardner等人，Fertil.Steril.，74，Suppl3，O-086；Gardner等人，HumReprod.，13，3434，3440；Gardner等人，J.Reprod.Immunol.，In press，和Hooper等人，Biol Reprod，62，Suppl1，249。在步骤i)中任选地衍生自1级或2级的受精卵母细胞的胚泡建立后，具有A级或B级的胚泡与饲养细胞共培养，以建立一个或多个内细胞团细胞集落。在种板于饲养细胞上后，监测其生长，且当集落足够大以手工传代时(种板后约1-2周)，细胞可与其它类型的细胞分开，通过在新饲养细胞上生长而扩增。内细胞团细胞的分离通过机械切开而实行，其可通过利用玻璃毛细管作为切割工具来进行。内细胞团细胞的检测可容易地通过显微镜目测完成，且相应的，不需要使用任何用酶和/或抗体损坏或移去滋养外胚层的对卵母细胞的处理。因此，本方法避免了使用免疫切除术。通过比较使用免疫切除术与可保持滋养外胚层完整的本方法的成功率，发现免除免疫切除术的本方法更简便、快捷且本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种获得多能人胚泡衍生的干细胞系的方法，包括步骤：ｉ）利用任选的具有１级或２级的受精的卵母细胞，以获得任选的具有Ａ级或Ｂ级的胚泡；ｉｉ）将胚泡与饲养细胞共培养，以建立一个或多个内细胞团细胞的集落；ｉｉｉ）通过机械切开 分离内细胞团细胞；ｉｖ）将内细胞团细胞与饲养细胞共培养，以获得胚泡衍生的干细胞系；ｖ）任选的，增殖胚泡衍生的干细胞系。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：H塞姆，A汤宁，
申请(专利权)人：塞拉提斯股份公司，
类型：发明
国别省市：SE[瑞典]