本发明专利技术提供了一种通过培养Ｈｅｌａ细胞制备人乳头状瘤病毒的方法。该方法利用Ｈｅｌａ细胞在含新生小牛血清的Ｄ－ＭＥＭ培养液，待细胞生长成片以后吸弃培养液，用不含牛血清的Ｄ－ＭＥＭ培养液洗涤细胞后，再在３３～３５℃静置培养１０～１４天至Ｈｅｌａ细胞出现脱落现象时停止，收集培养液并在４℃１００００ｒｐｍ离心分离，收获上清后经纯化得人乳头状瘤病毒。本发明专利技术病毒经形态学鉴定可见典型人乳头瘤病毒，经基因分析确定为人乳头瘤病毒基因。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物领域，涉及一种生物病毒的制备方法，具体涉及一种通过培养Hela细胞制备人乳头状瘤病毒(human papillomavirus，HPV)的方法。
技术介绍
人乳头状瘤病毒(human papillomavirus，HPV)是一组无包膜的小DNA病毒，能诱发人和多种高级脊椎动物的皮肤、粘摸产生疣和乳头状瘤。国际癌症研究中心公布的研究结果证实，HPV与宫颈癌有密切关系。宫颈癌组织中HPVDNA阳性率高达90％，在世界范围内子宫颈癌的发病率为女性恶性肿瘤发病的第二位，在某些发展中国家则居首位。据统计，全世界每年约500,000妇女死于宫颈癌，而我国妇女宫颈癌中HPV基因阳性率达80％以上。因此人乳头状瘤病毒(human papillomavirus，HPV)的研究、培养及疫苗的制备工作已经是刻不容缓。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种通过培养Hela细胞制备人乳头状瘤病毒的方法。本专利技术的目的可以通过以下措施实现一种通过培养Hela细胞制备人乳头状瘤病毒的方法，包括以下步骤①细胞培养取液氮冻存的Hela细胞，复苏后加入适宜培养液，在37℃静置培养3～4天，待细胞生长成片以后吸弃培养液，并用适宜的培养液洗涤细胞，再在33～35℃培养至Hela细胞出现脱落现象时停止；②病毒收获收集培养液并冻融，然后在4℃10000rpm离心，收获上清得人乳头状瘤病毒；③病毒纯化采用蔗糖密度梯度离心或柱层析纯化病毒。步骤①所述用于细胞培养的培养液为含小牛血清的D-MEM培养液。步骤①所述用于细胞洗涤的培养液为不含小牛血清的D-MEM培养液。步骤②所述中间可收获培养液，并换入新的无血清培养液继续培养。本专利技术病毒鉴定结果 1、形态学鉴定经纯化的病毒通过电镜观察，可见典型的乳头瘤病毒型态。2、基因分析用人乳头瘤病毒16型特异性PCR引物可以扩增出特异性DNA片段。对该PCR片段进行基因序列测定及分析确定为人乳头瘤病毒基因(16型)。具体实施例方式实施例一一种通过培养Hela细胞制备人乳头状瘤病毒的方法，包括以下步骤①细胞培养取液氮冻存的Hela细胞，复苏后加入含新生小牛血清的D-MEM培养液，置于37℃静置培养3～4天，待细胞生长成片以后吸弃培养液，用不含牛血清的D-MEM培养液洗涤细胞3次，并在33～35℃静置培养10～14天至Hela细胞出现脱落现象时停止培养。中间可以收获培养液，并换入新的不含小牛血清的D-MEM培养液继续培养；②病毒收获收集培养液并与中间收获的培养液合并，冻融3次，于4℃10000rpm离心30分钟，收获上清得人乳头状瘤病毒；③病毒纯化采用蔗糖密度梯度离心纯化病毒。或柱层析纯化病毒。实施例二一种通过培养Hela细胞制备人乳头状瘤病毒的方法，包括以下步骤①细胞培养取液氮冻存的Hela细胞，复苏后加入含新生小牛血清的D-MEM培养液，置于37℃静置培养3～4天，待细胞生长成片以后吸弃培养液，用不含牛血清的D-MEM培养液洗涤细胞3次，并在33～35℃静置培养10～14天至Hela细胞出现脱落现象时停止培养。中间可以收获培养液，并换入新的无血清培养液继续培养；②病毒收获收集培养液并与中间收获的培养液合并，冻融3次，于4℃10000rpm离心30分钟，收获上清得人乳头状瘤病毒；③病毒纯化采用柱层析纯化病毒。权利要求1.一种通过培养Hela细胞制备人乳头状瘤病毒的方法，包括以下步骤①细胞培养取液氮冻存的Hela细胞，复苏后加入适宜培养液，在37℃静置培养3～4天，待细胞生长成片以后吸弃培养液，并用适宜的培养液洗涤细胞，再在33～35℃培养至Hela细胞出现脱落现象时停止；②病毒收获收集培养液并融冻，然后在4℃ 10000rpm离心，收获上清得人乳头状瘤病毒；③病毒纯化采用蔗糖密度梯度离心或柱层析纯化病毒。2.如权利要求1所述的通过培养Hela细胞制备人乳头状瘤病毒的方法，其特征在于所述步骤①用于细胞培养的培养液为含小牛血清的D-MEM培养液。3.如权利要求1所述的通过培养Hela细胞制备人乳头状瘤病毒的方法，其特征在于所述步骤①用于细胞洗涤的培养液为不含小牛血清的D-MEM培养液。4.如权利要求1所述的通过培养Hela细胞制备人乳头状瘤病毒的方法，其特征在于所述步骤②中间收获培养液，并换入新的无血清培养液继续培养。全文摘要本专利技术提供了一种通过培养Hela细胞制备人乳头状瘤病毒的方法。该方法利用Hela细胞在含新生小牛血清的D－MEM培养液，待细胞生长成片以后吸弃培养液，用不含牛血清的D－MEM培养液洗涤细胞后，再在33～35℃静置培养10～14天至Hela细胞出现脱落现象时停止，收集培养液并在4℃10000rpm离心分离，收获上清后经纯化得人乳头状瘤病毒。本专利技术病毒经形态学鉴定可见典型人乳头瘤病毒，经基因分析确定为人乳头瘤病毒基因。文档编号C12N7/02GK1673362SQ20051004185公开日2005年9月28日 申请日期2005年3月19日 优先权日2005年3月19日专利技术者周旭, 余黎 申请人:兰州生物制品研究所本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种通过培养Ｈｅｌａ细胞制备人乳头状瘤病毒的方法，包括以下步骤：①细胞培养：取液氮冻存的Ｈｅｌａ细胞，复苏后加入适宜培养液，在３７℃静置培养３～４天，待细胞生长成片以后吸弃培养液，并用适宜的培养液洗涤细胞，再在３３～３５℃培养至Ｈｅｌａ细胞出现脱落现象时停止；②病毒收获：收集培养液并融冻，然后在４℃１００００ｒｐｍ离心，收获上清得人乳头状瘤病毒；③病毒纯化：采用蔗糖密度梯度离心或柱层析纯化病毒。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：周旭，余黎，
申请(专利权)人：兰州生物制品研究所，
类型：发明
国别省市：62[中国|甘肃]
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