本发明专利技术是一种小肠上皮细胞孔道调控蛋白的基因ＰＣＡＧ及制备和应用。小肠上皮细胞孔道调控蛋白的基因ＰＣＡＧ的制备方法是：１）使用大肠杆菌Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ系统表达该基因蛋白；２）使用酵母菌及其他真核细胞系统表达该基因蛋白。定位筛选到大肠杆菌源的小肠壁通透性调控蛋白完整基因ＰＣＡＧ。本发明专利技术既可创造可观的经济价值，又给注射病人带来福音，深受患者的喜爱，市场使用广泛，全世界糖尿病患者预测有１０％使用胰岛素给药口服液，每位患者每年医药费利润预计１００元，则每年创利１０亿元。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及医药
，具体地说是小肠上皮细胞孔道调控基因PCAG(自命名)及制备和应用。
技术介绍
一个世纪以来，生命科学界一直认为小肠上皮是紧密排列不可改变和调控的天然的、绝对的屏障，(intercellular tight junction，TJ)，因而，胰岛素，生长激素、干扰素、白细胞介素、红血球生成素等大分子蛋白、多肽类生物药物都以注射的药物剂型生产和使用，给病人带来诸多痛苦及不便。近十年来，在细菌病理学上，相关配合学科的综合研究，获得若干有重大意义的突破。近年来对若干与人有直接关系的微生物基因组(如大肠杆菌)的全基因测序完成，改变及完善了科学家对细菌一宿主间相互作用的观念。分子细菌学研究从分子水平向纵深发展 导致细菌一宿主细胞相互作用方面获得若干新的进展，最重要的是通过细胞骨架和细胞间隙信号传递可实现对小肠壁通透性的改变和调控的这一重大发现。过去几十年的生物研究发现，人体伴随发育学、生理学、病理学方面的体况不同，小肠上皮屏障(intestinal epithelial barrier，.IEB)是可以发生动力学改变的，而且TJ随IEB环境的变化改变很快。1991年已由美国马里兰大学发现的ZOT(Zonula Occludens Toxin)基因及其表达蛋白，已证实可以可逆性的打开小肠上皮细胞孔道20至40分钟左右，从而实现大分子药物的口服吸收。但由于该功能蛋白发现有轻度致腹泻副作用，至今未被医药业采用。糖尿病已成为严重威胁人类健康的世界性公共卫生问题。现今全世界糖尿病患者总数约为1.35亿，我国糖尿病患者现有4000万，以一个糖尿病人为例中等维持剂量用胰岛素如每天30μ，每一月就需付出259.50元。自我皮肉注射起码每天一次，皮肉注射给病人带来痛苦，相当一层病人表示，只要能维持正常血糖水平，如能以口服取代注射，则患者免受长期皮肉注射所带来的痛苦。
技术实现思路
本专利技术的目是提供一种通过对人体功能基因PCAG的发现，实现基因PCAG在蛋白、多肽类药物从注射给药到口服给药的新型制药工艺上的应用，以及该基因的制备方法。本专利技术以美国马里兰大学Alessio教授等提出的调控小肠壁通透性理论为研究思路，在他们用了不同来源的功能蛋白进行的动物体内外小肠壁通透性试验，发现ZOT/PCAG等是一类同功异源性功能蛋白的基础上，从蛋白功能转到其基因结构及筛选，进行了大量的深入研究，我们发现除Alessio等从霍乱弧菌源分离的ZOT基因外，在人体肠道大肠杆菌系统及T4噬菌体系统内也有一个此类异源性同功能蛋白及其基因存在。并制备了人体肠道大肠杆菌基因组的COSMID(柯斯质粒)一全基因库，使用此类调控小肠壁通透性类蛋白(ZOT)的抗体血清从蛋白水平，及从蛋白信息合成DNA探针的基因水平，定位及筛选出完整小肠壁通透性调控功能基因，本人命名其为PCAG基因，实现了将大分子蛋白、多肽药物由注射改成口服给药技术的关键突破。1.小肠上皮细胞孔道调控蛋白的基因PCAG DNA核苷酸顺序如下atgcaagagagacacacggaacaggactatcgtgccctgctgattgctgatacgcccattattgatgttcgcgcccctatcgagtttgagcacggcgcaatgcccgccgctatcaatctgccgttaatgaataacgatgaacgcgccgccgttggcacctgctataaacagcaaggctcagacgcagcgctggcgctgggacataaactggtggcgggtgaaattcgtcagcagcgcatggacgcctggcgggcagcgtgcctgcaaaatccgcaaggtattctctgctgcgcccgtggcggtcagcgctcacatattgtgcaaagctggttgcatgcagcggggattgattatccgctggtggaaggcggttataaggcactgcgccagaccgcgattcaggcgactattgaactggcacaaaaaccgatagtgctgattggcggttgtaccggcagcggtaaaacgctgttagtgcagcaacagccgaacggtgttgatctggaagggttggcgcgtcatcgcggttcggcgtttggtcgcacgttacaaccacaacttagccaggcgagttttgaaaacctgctggctgccgaaatgctaaaaaccgacgcccgtcagaatttgcgcctgtgggtgctggaagacgaaagccggatg atcggttcgaatcacctgccggaatgcctgcgcgagcgaatgactcaggcggcgattgcggtggtagaagatccgtttgagatccgtcttgagcgcctgaacgaagagtatttcttgcgtatgcatcatgattttacccacgcgtacggcgacgaacagggctggcaggagtattgcgaatacctgcatcacggactttcggcgattaagcgtcggctggggctacagcgctataacgaactggctgcaaggctggatgcagcactgacaacgcaactcaccaccggcagcaccgacggtcatctggcctggctggtgccgttacttgaagaatattacgacccgatgtatcgctatcagcttgagaaaaaagcggaaaaagttgtctttcgcggtgagtgggcggaagtggcggaatgggttaaggcgcggtaa以上所述的小肠上皮细胞孔道调控蛋白的基因PCAG的制备方法包括1)使用大肠杆菌Escherichia coli系统表达该基因蛋白；2)使用酵母菌及其他真核细胞系统表达该基因蛋白，即1)将致病性大肠杆菌E.coli.CT-58和非致病性大肠杆菌E.coli.MG1655、E.coli.0157、E.coli.CR63、E.coli.Be、E.coli.XL-1这几种细菌表达的完全蛋白跑聚丙烯酰胺凝胶电泳，转硝酸纤维素膜，用小肠壁通透性调控蛋白的抗体做免疫杂交后，出现几种细菌都有一条清晰的阳性条带，分离、纯化这一条带蛋白，胰蛋白酶处理，对小片段进行C端氨基酸测序，以此结果作为筛选大肠杆菌基因库的核酸探针信息；2)用Cosmid作载体，构建非致病性大肠杆菌E.coli.MG1655的全基因组基因库，按以上小肠壁通透性调控蛋白信息合成脱氧核酸DNA探针，P32放射性同位素标记，从基因库中钓出一个阳性克隆DNA测序结果，得到530bp长度的一个小肠壁通透性调控蛋白基因，其5’，3’两端编码的氨基酸顺序，与探针来源的小肠壁通透性调控蛋白一个小片段的两端实际测得氨基酸顺序完全相同，由此得到了大肠杆菌源的小肠壁通透性调控蛋白基因，用此基因序列进一步与国际NCBI的基因核酸数据库序列做BLAST(基因同源性检测)，所得的基因片断与E.coli.基因组上的6205-6702之间的序列完全一致，由此定位筛选到大肠杆菌源的小肠壁通透性调控蛋白完整基因PCAG。3.小肠上皮细胞孔道调控基因PCAG的应用本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种小肠上皮细胞孔道调控蛋白的基因ＰＣＡＧ，其特征在于ＰＣＡＧ基因ＤＮＡ核苷酸顺序如下：ａｔｇｃａａｇａｇａｇａｃａｃａｃｇｇａａｃａｇｇａｃｔａｔｃｇｔｇｃｃｃｔｇｃｔｇａｔｔｇｃｔｇａｔａｃｇｃｃｃａｔｔａｔｔｇａｔｇｔ ｔｃｇｃｇｃｃｃｃｔａｔｃｇａｇｔｔｔｇａｇｃａｃｇｇｃｇｃａａｔｇｃｃｃｇｃｃｇｃｔａｔｃａａｔｃｔｇ ｃｃｇｔｔａａｔｇａａｔａａｃｇａｔｇａａｃｇｃｇｃｃｇｃｃｇｔｔｇｇｃａｃｃｔｇｃｔａｔａａａｃａｇｃａａｇｇｃｔｃａ ｇａｃｇｃａｇｃｇｃｔｇｇｃｇｃｔｇｇｇａｃａｔａａａｃｔｇｇｔｇｇｃｇｇｇｔｇａａａｔｔｃｇｔｃａｇｃａｇｃｇｃａｔｇｇａｃｇｃｃｔｇｇｃｇｇｇｃａｇｃｇｔｇｃｃｔｇｃａａａａｔｃｃｇｃａａｇｇｔａｔｔｃｔｃｔｇｃｔｇｃｇｃｃｃ ｇｔｇｇｃｇｇｔｃａｇｃｇｃｔｃａｃａｔａｔｔｇｔｇｃａａａｇｃｔｇｇｔｔｇｃａｔｇｃａｇｃｇｇｇｇａｔｔｇａｔｔａｔｃｃｇｃｔｇｇｔｇｇａａｇｇｃｇｇｔｔａｔａａｇｇｃａｃｔｇｃｇｃｃａｇａｃｃｇｃｇａｔｔｃａｇｇｃｇａｃ ｔａｔｔｇａａｃｔｇｇｃａｃａａａａａｃｃｇａｔａｇｔｇｃｔｇａｔｔｇｇｃｇｇｔｔｇｔａｃｃｇｇｃａｇｃｇｇｔａａａａｃｇｃｔｇｔｔａｇｔｇｃａｇｃａａｃａｇｃｃｇａａｃｇｇｔｇｔｔｇａｔｃｔｇｇａａｇｇｇｔｔｇｇｃｇｃｇｔ ｃａｔｃｇｃｇｇｔｔｃｇｇｃｇｔｔｔｇｇｔｃｇｃａｃｇｔｔａｃａａｃｃａｃａａｃｔｔａｇｃｃａｇｇｃｇａｇｔｔｔｔｇａａａａｃｃｔｇｃｔｇｇｃｔｇｃｃｇａａａｔｇｃｔａａａａａｃｃｇａｃｇｃｃｃｇｔｃａｇａａｔｔｔｇｃｇｃｃ ｔｇｔｇｇｇｔｇｃｔｇｇａａｇａｃｇａａａｇｃｃｇｇａｔｇａｔｃｇｇｔｔｃｇａａｔｃａｃｃｔｇｃｃｇｇａａｔｇｃｃｔｇｃｇｃｇａｇｃｇａａｔｇａｃｔｃａｇｇｃｇｇｃｇａｔｔｇｃｇｇｔｇｇｔａｇａａｇａｔｃｃｇｔｔｔｇａｇａｔ ｃｃｇｔｃｔｔｇａｇｃｇｃｃｔｇａａｃｇａａｇａｇｔａｔｔｔｃｔｔｇｃｇｔａｔｇｃａｔｃａｔｇａｔｔｔｔａｃｃｃａｃｇｃｇｔａｃｇｇｃｇａｃｇａａｃａｇｇｇｃｔｇｇｃａｇｇａｇｔａｔｔｇｃｇａａｔａｃｃｔｇｃａｔｃａｃｇｇａ ｃｔｔｔｃｇｇｃｇａｔｔａａｇｃｇｔｃｇｇｃｔｇｇｇｇｃｔａｃａｇｃｇｃｔａｔａａｃｇａａｃｔｇｇｃｔｇｃａａｇｇｃｔｇｇａｔ...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：任兆钧，
申请(专利权)人：任兆钧，广州铭俊基因技术开发有限公司，
类型：发明
国别省市：81[中国|广州]
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