用于选择含有编码针对毒性分子的解毒剂蛋白的序列的重组克隆的方法技术

本发明专利技术涉及一种用于选择整合了目的基因（６）和编码针对毒性分子（５）的功能性解毒剂蛋白（４）的核苷酸序列（３）的重组克隆的方法，其中所述重组克隆是被整合到宿主细胞（２０）中后仍存活的重组克隆，所述宿主细胞的基因组中含有编码所述毒性分子（５）的核苷酸序列（２１）。本发明专利技术还涉及核酸构建体，含有所述核酸构建体的载体，宿主细胞和用于实施所述方法的克隆和／或测序试剂盒。（*该技术在2022年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于重组DNA技术的领域。更准确地说，本专利技术涉及一种方法，一种核酸构建体，一种载体和一种用于选择重组克隆的细胞，该重组克隆含有编码针对毒性分子的解毒剂蛋白的序列。
技术介绍
及现有技术有可能将DNA插入片段克隆到载体中而不需要选择重组体，却需要花费时间进行利用放射性标记探针的杂交鉴定，通过限制性酶切小规模制备的质粒进行筛选或在有X-Gal存在的条件下基于α互补失活进行筛选(蓝/白筛选)。这些用了十多年的方法并不适应大规模的克隆计划，该计划将在完整基因组测序计划之后出现。可获得的序列信息已经迅猛增加而且在将来还将进一步增加。为了评价已被鉴定的编码序列的生物学功能，必须对生物体基因组中的其相应基因进行特异性突变(缺失或修饰)(例如在剔除小鼠中)，以便研究与引入的突变相关的表型。突变的特异性是由导向载体(在大肠杆菌中构建的)所给予的，所述导向载体含有同源重组臂。如果测序技术的发展能够满足测序基因数目迅猛增加的需要，为了获得重组克隆和得到相应基因功能的相关资料而对基因进行大规模的克隆和亚克隆仍然是功能性基因组计划的限制性步骤。对每种基因进行克隆和亚克隆是“功能性基因组计划”的瓶颈。因此需要加快这些进程的新克隆方法。由于重组体的鉴定是一个限制性步骤，因此很清楚需要进行重组体的正选择来由传统的方法进展到进行高产量克隆，从而能够处理成千上万的基因。已经提出了能够直接选择(正选择)重组菌株的克隆载体(例如，参见Pierce等，1992；Kuhn等.1986)。然而，大多数克隆载体表现出下列缺点(i)它们不能被用来引入大的核苷酸片段，(ii)它们不易操作处理，以及(iv)它们不能由微生物以多拷贝来进行制备且不导致所述微生物死亡。而且，传统的限制性酶切和连接酶反应可以被位点专一性重组所取代，而且重组体可以通过所感兴趣的插入片段取代ccdB基因(毒物/解毒剂基因家族的成员)来进行选择(美国专利US5,910,438，US6,180,407和国际专利WO 99/58652)。含CcdB的载体比其它正选择系统具有下列主要优势i)其选择基因小(ccdB303bp)，ii)所述载体能在一种宿主中扩增，该宿主含有一个赋予其针对CcdB毒物的总体抗性的突变(gyrA462抗性菌株；Bernard和Couturier，1992)。由于大肠杆菌是大多数分子克隆技术方案所采用的宿主，所以研制能够增强和拓宽克隆可能性范围的新型系统是非常重要的。利用CcdB的正选择技术已被用来构建适于特殊目的的新载体PCR克隆载体(Gabant等，1997)，适于细菌遗传学的载体(Gabant等，1998)，而且最近采用一种属于CcdB家族的kid基因设计了新型的克隆载体(Gabant等，2000和WO01/46444)。CcdB基因用途的另一个实例由美国专利US5,888,732给出。该文献公开了被称作″通道系统(the Gateway system)″的克隆方法的基本原理。在该方法中，传统的限制性酶切和连接酶反应被位点专一性重组位点所取代而且通过插入目的基因致使ccdB基因失活(通过缺失)来选择重组体。该方法使得生物体的所有基因通过自主亚克隆而快速并有效地由一个载体转移到不同的载体(即表达载体)。所产生的亚克隆保留了允许进行翻译融合的定向以及读框(有关综述参见Hartley等，2000)。然而，所述技术是基于可反选择基因，需要使用rpsl，tetR，sacB或ccdB可反选择基因，从而产生一种无缝的第二轮产物，该产物没有从第一轮重组中携带上″疤(scar)″。由于目的重组只是若干种反选择压力方案中的一种，所以反选择(用于选择毒性基因的失活或缺失)通常比正选择(新性能的获得)效率低。任何消除可反选择基因表达的突变事件也将在反选择压力下生长。因此对于罕见的遗传事件(其发生频率与可反选择基因的突变失活相当)来说，需要对来自第二轮反选择策略的候选物进行筛选从而找出所需的重组事件。在实践中，由于存在着一些仍然不确定的因素，目的产物与不需要的产物之比的变化范围似乎很宽(从＜1％至15％-85％)(Muyrers G.P.P.，Trends in Biochemical Sciences，Vol.26，no.5，p.325-331，2001)。本专利技术的目的本专利技术的目的在于提供一种新的和改进的方法和产品，其克服了现有技术的缺点并使得对重组克隆的正选择得到改进。本专利技术的具体目的是提供这样的方法和产品，其能进行罕见遗传事件的选择，尤其是能选择整合了长DNA片段的重组克隆。本专利技术的另一个目的是提供一种方法和产品，其不受用于所述正选择的在细胞中发生的抗性突变的影响或者受其影响较小。本专利技术的概述本专利技术的第一个方面涉及一种用于选择整合了一个目的基因和一条编码针对毒性分子(针对一种细胞，优选原核细胞)的功能性解毒剂蛋白的核苷酸序列的重组克隆的方法，其中所述重组克隆是被整合到宿主细胞中后仍存活的重组克隆，所述宿主细胞的基因组中含有编码所述毒性分子的核苷酸序列。本专利技术的另一个方面涉及被用来实施所述方法的产品，具体地是含有至少一条盒式核苷酸序列的核酸构建体，所述盒式核苷酸序列由至 少一条编码针对毒性分子(针对一种细胞，优选地一种原核细胞)的解毒剂蛋白的核苷酸序列和一个目的基因或一个用于所述目的基因的插入位点(优选地，所述插入位点不在编码所述解毒剂蛋白的核苷酸序列中)构成；所述盒式核苷酸序列处于所述核酸构建体的第一个重组位点和第二个重组位点之间(所述第一个重组位点和所述的第二个重组位点互相不重组)。根据本专利技术的一个优选实施方案，解毒剂蛋白和毒性分子分别是一种抗-毒物蛋白和一种毒物蛋白。所述抗-毒物或毒物蛋白可以是野生型蛋白或者经修饰的蛋白，其天然具有毒性或经人工的方式而具有毒性，影响细胞(优选原核细胞)的一种或多种生活机能并且可能导致杀死细胞。解毒剂蛋白和毒性分子优选地选自CcdA/CcdB蛋白，Kis/Kid蛋白，Phd/Doc蛋白，SoK/HoK蛋白，RelB/relE蛋白，PasB(或PasC)/PasA蛋白，mazF/mazE蛋白或任何其它质粒来源或非质粒来源的抗-毒物/毒物分子对。毒性分子也可以是一种天然具有毒性或经人工的方式而具有毒性的毒素蛋白并且影响细胞(原核细胞)的一种或多种生活机能。由基因sacB编码的蛋白(来源于解淀粉芽孢杆菌)，蛋白GpE，蛋白GATA-1和蛋白Crp是这种毒性分子的其它实例。基因sacB编码能催化蔗糖水解成对大肠杆菌具有毒性的产物的果聚糖蔗糖酶(Pierce等.Proc.Natl.Acad.Sci.，Vol.89，N°6(1992)，pp2056-2060)。源自噬菌体X174的E基因编码蛋白GpE，所述E基因含有六个独特的限制位点和编码gpE并且引起大肠杆菌细胞的裂解(Heinrich等，Gene，Vol.42n°3(1986)，pp345-349)。蛋白GATA-1由Trudel等记载(Biotechniques 1996，Vol.20(4)，PP684-693)。蛋白Crp已由Schlieper等记载(Anal.Biochem.1998，Vol.257(2)，p.203-209)。针对所述毒性分子的解毒剂蛋白是任何能够减本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于选择整合了目的基因（６）和编码针对毒性分子（５）的功能性解毒剂蛋白（４）的核苷酸序列（３）的重组克隆的方法，其中所述重组克隆是被整合到宿主细胞（２０）中后仍存活的重组克隆，所述宿主细胞的基因组中含有编码所述毒性分子（５）的核苷酸序列（２１）。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：P伽班特，L范枚尔德伦，CY斯皮尔，
申请(专利权)人：布鲁塞尔自由大学，
类型：发明
国别省市：BE[比利时]