一种以加热调控细胞因子表达的方法及其在肿瘤治疗中的应用技术

本发明专利技术属生物医学领域，涉及一种以加热调控细胞因子表达的方法及其在肿瘤治疗中的应用。本发明专利技术采用局部加热调控免疫刺激细胞因子基因表达，使基因靶向地在肿瘤及其周围组织中表达。本方法通过构建人工基因表达盒实现，将热诱导表达基因启动子置于细胞因子编码基因上游调控细胞因子基因表达。在人工基因表达盒输送到肿瘤及其周围区域后，再采用局部加热诱导细胞因子基因表达，达到消除局部肿瘤并诱导全身抗肿瘤免疫的目的。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属生物医学领域，涉及一种以加热调控细胞因子表达的方法，尤其是采用局部加热控制免疫刺激细胞因子基因表达的方法，及其在肿瘤治疗中的应用。
技术介绍
目前恶性肿瘤仍然是威胁人类健康和生命的最主要的疾病。现有的各种治疗方法(包括手术、放疗和化疗)仅对局限的肿瘤病灶有效，而对于播散或复发的肿瘤疗效不佳。因此，迫切需要建立新的肿瘤治疗方法，这也是当今人类所面临的最大挑战之一。基因治疗为解决恶性肿瘤的治疗问题提供了许多良机，其中最主要是因为基因治疗能显著拓宽肿瘤的治疗窗。随着人类基因组计划和后基因组计划的实施，治疗基因的选择更广泛，调控治疗基因表达的方法也会更多。因此，有可能做到选择性杀伤肿瘤细胞而对正常细胞和组织损伤较小。不仅可改善治疗效果，还能减轻毒、副作用。为了达到最大限度杀伤肿瘤细胞同时又不损伤或很少损伤正常组织细胞的目的，在设计肿瘤基因治疗策略和方法时必须考虑以下三点。1.强效的抗肿瘤治疗基因；2.高效地将治疗基因输送到肿瘤内；3.有效地调控治疗基因在肿瘤内表达；目前已发现的哺乳动物细胞基因中，受调控最强的基因是热休克蛋白(heatshock protein)基因家族。这些基因具有广泛的功能，是护送新合成的蛋白质到它们的亚细胞部位的护卫者；并且在环境重压(stress)时如热压力、化学压力或外源微生物感染时被激活的压力反应蛋白(stress response protein)。热休克蛋白的最突出的特征是当温度超过正常生理温度5-6℃时其表达可上调数千倍，此时细胞中90％以上的蛋白合成器都转而产生热休克蛋白。已有研究证实，热休克蛋白的调控主要发生在转录水平，位于热休克蛋白基因5’端的启动子起着关键作用。热休克蛋白启动子是哺乳动物细胞中最强的启动子之一，为调控治疗基因表达提供了最佳的选择。热疗(hyperthermia)和热消融(thermalablation)技术目前已应用于各种实体瘤的治疗，但迄今尚无将上述因素有机结合用于医疗实践的报道。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种以加热调控细胞因子表达的方法，尤其是采用局部加热控制免疫刺激细胞因子基因表达的方法。本专利技术进一步的目的是提供所述方法在肿瘤治疗中的应用。本专利技术方法的技术方案包括使用热休克蛋白基因启动子和免疫刺激细胞因子基因构建人工基因，所述人工基因具有将免疫刺激基因靶向在肿瘤内表达的潜力，然后采用微波或超生或射频等方式加热肿瘤，使肿瘤局部温度增加3-5度，使得免疫调控基因在肿瘤局部选择性、高效表达，达到清除局部和全身肿瘤的目的。本专利技术所述的免疫刺激细胞因子包括白细胞介素2、12、18和21如IL2、IL12、18、21；干扰素α、β、γ(Interferonsα、β、γ)；肿瘤坏死因子α(TNF-α)、粒、巨细胞集落刺激因子(GM-CSF)、及其他肿瘤杀伤基因如TRAIL。本方法将治疗基因置于热休克蛋白基因启动子下构建人工基因，通过对肿瘤局部进行加热调控治疗基因在肿瘤局部表达进而实现治疗肿瘤的效果。所述方法对于那些既有强烈的抗肿瘤作用又对正常细胞和组织有较大毒性的治疗基因尤为有利和重要。本方法可用于清除局部肿瘤并激发全身抗肿瘤反应。可单独使用，也可与放射治疗、化疗或热疗(包括热消融)结合用于肿瘤的治疗。本专利技术优先选用免疫刺激基因为治疗基因，其具有以下优点1.强效；2.具旁观者效应；3.在局部应用时也能有较激发全身抗肿瘤反应。热诱导的细胞因子基因治疗和免疫治疗的关键是设计并构建人工基因，即将细胞因子编码基因置于热诱导的启动子调控之下，然后进一步将人工基因插入到病毒或非病毒基因治疗载体中，再将病毒或非病毒载体直接应用到肿瘤块或肿瘤周围的正常组织，采用局部加热处理肿瘤。所述局部加热的方法包括微波、射频、高强度超声等，使肿瘤及其周围组织的温度上升3℃以上，在这种温度条件下热休克蛋白基因的启动子高度活化，激活高水平的治疗基因表达。本专利技术采用的热休克蛋白基因启动子包括下述基因，但不限于下述基因，即Hsp70、Hsp70B，可使用的细胞因子基因包括但不局限于下述基因的单独或联合使用，即IL2，IL4、IL12、IL18、Interferons、TNF-α、TRAIL、FasL、GM-CSF等。在上述技术方案中局部加热、热调控的治疗基因表达和热调控的其他基因表达的结合，将对局部和全身肿瘤起到强效的抗肿瘤效果。本专利技术方法包括下述步骤1.采用PCR或其他已知的方法分离并克隆人热休克蛋白基因的启动子顺序；2.克隆免疫刺激/肿瘤杀伤细胞因子基因cDNA；3.将免疫刺激/肿瘤杀伤细胞因子基因cDNA置于热休克蛋白基因启动子之下，构建人工基因；4.将带有polyA尾的人工基因插入到病毒或非病毒载体中，所述病毒载体包括腺病毒、慢病毒等，非病毒载体包括裸质粒DNA和脂质体-质粒DNA复合物等；5.将上述载体注入到肿瘤内或肿瘤周围的组织中；6.对肿瘤局部及其周围组织进行加热，加热可采用热垫、微波、射频或局部超声等方式。上述方法也可与现存的治疗方法如化疗、放疗及外科治疗等结合，本专利技术加热调控的细胞因子表达基因的方法其最突出优点如下1.治疗基因靶向性在肿瘤及肿瘤周围组织中表达，明显降低了对身体其他部位正常组织的毒、副作用——靶向性；2.可根据需要启动或关闭细胞因子基因的表达——可调控性；3.尽管治疗基因在肿瘤局部表达，免疫刺激细胞因子不仅具有杀伤局部肿瘤的作用，还能够诱导全身抗肿瘤免疫反应——系统作用与强效。附图说明图1是加热调控的mIL12表达载体构建示意图，和热诱导细胞因子基因表达实施示意图。图2由腺病毒介道的报道基因绿色荧光蛋白在肿瘤细胞和肿瘤组织中的经热引发的表达。其中，A是体外培养的小鼠乳腺癌细胞4T1经20MOI Ad-HSP-GFP感染，24小时后42℃水浴中加热30分钟，37℃培养24小时后，荧光显微镜观察GFP表达。感染及加热后细胞表达GFP明显增加。B是.将1×106小鼠乳腺癌细胞4T1注射到Balb/c小鼠背部肿瘤视窗模型，待肿瘤生长至直径1mm大小时，用1ml注射器将50ul含1×108pfu Ad-HSP-GFP注射到视窗内。24小时后将视窗浸入42℃水浴中加热45分钟。加热后24小时后麻醉小鼠，在荧光显微镜下观察，加热后GFP表达量明显增加。图3是体外培养的肿瘤细胞或体内生长的肿瘤组织经Ad-HSP-mIL12感染及加热后表达mIL12的情况。其中A是.体外培养的小鼠乳腺癌细胞4T1经20MOI Ad-HSP-mIL12感染，24小时后收集细胞培养液，然后在42℃水浴中加热30分钟，37℃继续培养24小时后，再次收集细胞培养液。采用R&D公司的mIL12 Elisa检测试剂盒检测加热前后细胞培养液内mIL12含量，可见加热后细胞表达mIL12明显增加，mIL12甚至可增加104倍以上。B是.加热诱导的mIL12在肿瘤组织内表达，将1×106小鼠乳腺癌细胞4T1注射到Balb/c小鼠后腿皮下，待肿瘤生长至直径7～8mm大小时，用1ml注射器将100ul含1×108pfu Ad-HSP-mIL12注射到肿瘤内。24小时后将皮下肿瘤浸入42℃水浴中加热45分钟。加热后48小时麻醉小鼠，取出肿瘤，匀浆后Elisa检测mIL12含量，本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种以加热调控细胞因子表达的方法，其特征是采用热诱导表达基因的启动子调控免疫刺激基因表达，包括下述步骤：（１）分离并克隆人热休克蛋白基因的启动子顺序；（２）克隆免疫刺激／肿瘤杀伤细胞因子基因ｃＤＮＡ；（３）将上述免疫 刺激／肿瘤杀伤细胞因子基因ｃＤＮＡ置于热休克蛋白基因启动子之下，构建人工基因；（４）将上述人工基因插入病毒或非病毒载体中；（５）将上述载体注入到肿瘤内或肿瘤周围的组织中；（６）对肿瘤局部及其周围组织进行加热。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：李川源，黄倩，
申请(专利权)人：李川源，黄倩，
类型：发明
国别省市：65[中国|新疆]