组合型血清代谢标志物在制备用于诊断肝病发展进程试剂盒的用途、试剂盒及其筛选方法技术

本发明专利技术提供了一种组合型血清代谢标志物在制备用于诊断肝病发展进程试剂盒的用途、试剂盒及其筛选方法，涉及血清代谢标志物技术领域，所述组合型血清代谢标志物主要由甘氨鹅脱氧胆酸钠硫酸钠、甘氨鹅脱氧胆酸、甘氨脱氧胆酸、甘氨胆酸和牛磺鹅脱氧胆酸组成。本发明专利技术通过试剂盒对上述血清代谢物在血清中的含量进行组合型筛选检测，可以对肝病患者的肝病发展进程进行辅助诊断，进而有效缓解了现有肝病临床治疗中肝病发生发展监控困难的问题。

The use of combined serum metabolic markers in the preparation of a kit for the diagnosis of liver disease development, kits and screening methods

【技术实现步骤摘要】
组合型血清代谢标志物在制备用于诊断肝病发展进程试剂盒的用途、试剂盒及其筛选方法
本专利技术涉及血清代谢标志物
，尤其是涉及一种组合型血清代谢标志物在制备用于诊断肝病发展进程试剂盒的用途、试剂盒及其筛选方法。
技术介绍
目前，我国乙肝病毒携带者已超过1.2亿人，发病人数超过3000万人。然而，仅有1％的乙肝患者接受治疗。其中，慢性乙型肝炎是导致肝硬化的主要原因。肝硬化在临床中较为多见，如果不能及时有效控制，可导致腹水、上消化道出血、肝性脑病、继发感染、癌变等严重并发症，甚至危及生命。因此对患者的肝病发展进程进行判断，并对患者肝病的发生发展予以有效监控，对该病的有效治疗极为关键。现有的临床检测肝病发展进程的检测手段一般为肝组织活检或常规的影像及临床生化检测。但这些方法也都存在一些问题，其中肝组织活检虽然为肝病发展进程检验的金标准，然而，此种方法给患者身体和心理都造成了极大的痛苦。同时，常规的影像及临床生化检测方法尚不能对早期肝硬化进行诊断和分级。因此，研究开发一种用于诊断肝病发展进程试剂盒，该试剂盒具有检测速度快、检测成本低的优点，可以对肝病患者的肝病发展进程进行快速诊断，有效缓解了现有肝病临床治疗中肝病发生发展监控困难的问题，具有非常好的科研和商业应用前景。有鉴于此，特提出本专利技术。
技术实现思路
本专利技术的第一目的在于提供一种组合型血清代谢标志物在制备用于诊断肝病发展进程试剂盒的用途，由该组合型血清代谢标志物制备的试剂盒能够应用于肝病患者的肝病发展进程的诊断。本专利技术的第二目的在于提供一种用于诊断肝病发展进程试剂盒，该试剂盒可以对肝病患者的肝病发展进程进行快速诊断，有效缓解了现有肝病临床治疗中肝病发生发展监控困难的问题。本专利技术的第三目的在于提供一种所述的用于诊断肝病发展进程试剂盒筛选组合型血清代谢标志物的方法，该方法具有筛选速度快、筛选成本低，可以进行批量筛选的优点，能很好的对患者血清中的组合型血清代谢标志物进行筛选。本专利技术提供的组合型血清代谢标志物在制备用于诊断肝病发展进程试剂盒的用途；所述组合型血清代谢标志物主要由甘氨鹅脱氧胆酸钠硫酸钠、甘氨鹅脱氧胆酸、甘氨脱氧胆酸、甘氨胆酸和牛磺鹅脱氧胆酸组成。本专利技术提供的用于诊断肝病发展进程试剂盒，所述试剂盒包括：标准品：甘氨鹅脱氧胆酸钠硫酸钠标准品、甘氨鹅脱氧胆酸标准品、甘氨脱氧胆酸标准品、甘氨胆酸标准品和牛磺鹅脱氧胆酸标准品；含内标提取液：浓度为0.01～1μmol/L的含有同位素内标甘氨鹅脱氧胆酸钠硫酸钠-d5的低碳醇溶液，浓度为0.01～1μmol/L的含有同位素内标甘氨胆酸-d5的低碳醇溶液，浓度为0.01～1μmol/L的含有同位素内标牛磺鹅脱氧胆酸-d5的低碳醇溶液。进一步的，上述含内标提取液中的低碳醇溶液为甲醇溶液。本专利技术提供的一种诊断肝病发展进程试剂盒筛选组合型血清代谢标志物的方法，包括以下步骤：(a)将人体血清与含内标提取液混合，得到混合液，随后对所述混合液进行预处理得到待测样本；(b)将所述待测样本通过液质联用检测，对人体血清中的组合型血清代谢标志物进行筛选。进一步的，上述步骤(a)预处理的步骤为：将混合液沉淀蛋白后，提取上清、冻干/氮气吹干，随后用甲醇溶液复溶后离心，取上清得到待测样本。进一步的，上述步骤(b)具体包括如下步骤：步骤(Ⅰ)：称取甘氨鹅脱氧胆酸钠硫酸钠、甘氨鹅脱氧胆酸、甘氨脱氧胆酸、甘氨胆酸和牛磺鹅脱氧胆酸标准品，用甲醇溶解，得到不同浓度的标准液；步骤(Ⅱ)：将上述含内标提取液分别加入步骤(Ⅰ)得到的标准液中，50％甲醇水定容后离心，取上清液作为待测标准液；步骤(Ⅲ)：将步骤(Ⅱ)得到的待测标准液和步骤(a)得到的待测样本通过液质联用检测，对人体血清中的组合型血清代谢标志物进行筛选。进一步的，上述步骤(Ⅲ)液质联用检测的液相色谱条件为：色谱柱为键合相色谱柱，进样量：5～50μL，流动相包括A和B，其中A为甲酸水溶液，B为乙腈溶液，流动相的流速为0.1～2.0mL/min；流动相的梯度(以体积百分比计)：0min，A：90～30％、B：10～70％；4min，A：90～50％、B：10～50％；5min，A：1～20％、B：99～80％；8min，A：1～20％、B：99～80％；8.1min，A：90～60％、B：10～40％；10min，A：90～60％、B：10～40％。进一步的，上述键合相色谱柱为C18或C8键合相色谱柱，规格为(50～100)mm×(1.8～3)mm，(1.7～4)μm。更进一步的，上述键合相色谱柱为C8键合相色谱柱，规格为50mm×2.1mm，1.7μm。进一步的，上述步骤(c)中液质联用检测的质谱条件为：采用ESI离子源，正离子MRM扫描，喷雾口位置：3∶7；雾化气流速：5～10L/min，气帘气流速：5～10L/min，碰撞气流速：5～10L/min，离子源电压：2500V，离子源温度：400℃。与现有技术相比，本专利技术的有益效果为：本专利技术提供的一种组合型血清代谢标志物在制备用于诊断肝病发展进程试剂盒的用途，所述组合型血清代谢标志物主要由甘氨鹅脱氧胆酸钠硫酸钠、甘氨鹅脱氧胆酸、甘氨脱氧胆酸、甘氨胆酸和牛磺鹅脱氧胆酸组成。本专利技术根据人体的很多生理生化代谢过程在肝脏中进行，因此，肝脏疾病可导致代谢过程的变化，从而造成人体血液中某些代谢物含量也会相应的变化的原理。经过研究肝炎、肝硬化、肝癌患者的血清代谢谱发现，通过对甘氨鹅脱氧胆酸钠硫酸钠、甘氨鹅脱氧胆酸、甘氨脱氧胆酸、甘氨胆酸和牛磺鹅脱氧胆酸上述血清代谢物进行组合型检测可以对肝病患者的肝病发展进程进行辅助诊断。本专利技术应用上述组合型血清代谢标志物制备用于诊断肝病发展进程试剂盒，有效缓解了现有肝病临床治疗中肝病发生发展监控困难的问题。本专利技术提供的一种用于诊断肝病发展进程试剂盒，该试剂盒可以对肝病患者的肝病发展进程进行快速诊断，有效缓解了现有肝病临床治疗中肝病发生发展监控困难的问题。本专利技术提供的一种所述的用于诊断肝病发展进程试剂盒筛选组合型血清代谢标志物的方法，该方法采用了液相分离和质谱分析联用的检测方法，实现对组合型血清代谢标志物甘氨鹅脱氧胆酸钠硫酸钠、甘氨鹅脱氧胆酸、甘氨脱氧胆酸、甘氨胆酸和牛磺鹅脱氧胆酸的定性和定量分析，具有筛选速度快、筛选成本低，可以进行批量筛选的优点，能很好的对患者血清中的组合型血清代谢标志物进行筛选，具有较高的应用价值。附图说明为了更清楚地说明本专利技术具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本专利技术的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。图1为实验例1中GCDCS/GCDCA、GCDCS/TCDCA和GDCA/GCA在各实验组中的比值分析图；图2为实验例2中GCDCS和GCA占总胆汁酸的比值图；图3为实验例2中GCDCS/GCDCA、GCDCS/TCDCA和GDCA/GCA在各实验组中的比值分析图；*表示与正常对照组具有显著性差异，***：p<0.001。具体实施方式下面将结合附图对本专利技术的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本专利技术一部分实施本文档来自技高网...

【技术保护点】
组合型血清代谢标志物在制备用于诊断肝病发展进程试剂盒的用途；所述组合型血清代谢标志物主要由甘氨鹅脱氧胆酸钠硫酸钠、甘氨鹅脱氧胆酸、甘氨脱氧胆酸、甘氨胆酸和牛磺鹅脱氧胆酸组成。

【技术特征摘要】
1.组合型血清代谢标志物在制备用于诊断肝病发展进程试剂盒的用途；所述组合型血清代谢标志物主要由甘氨鹅脱氧胆酸钠硫酸钠、甘氨鹅脱氧胆酸、甘氨脱氧胆酸、甘氨胆酸和牛磺鹅脱氧胆酸组成。2.一种用于诊断肝病发展进程的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：标准品：甘氨鹅脱氧胆酸钠硫酸钠标准品、甘氨鹅脱氧胆酸标准品、甘氨脱氧胆酸标准品、甘氨胆酸标准品和牛磺鹅脱氧胆酸标准品；含内标提取液：浓度为0.01～1μmol/L的含有同位素内标甘氨鹅脱氧胆酸钠硫酸钠-d5的低碳醇溶液，浓度为0.01～1μmol/L的含有同位素内标甘氨胆酸-d5的低碳醇溶液，浓度为0.01～1μmol/L的含有同位素内标牛磺鹅脱氧胆酸-d5的低碳醇溶液。3.根据权利要求2所述的用于诊断肝病发展进程试剂盒，其特征在于，所述含内标提取液中的低碳醇溶液为甲醇溶液。4.一种根据权利要求2或3所述的用于诊断肝病发展进程试剂盒筛选组合型血清代谢标志物的方法，其特征在于，包括以下步骤：(a)将人体血清与含内标提取液混合，得到混合液，随后对所述混合液进行预处理得到待测样本；(b)将所述待测样本通过液质联用检测，对人体血清中的组合型血清代谢标志物进行筛选。5.根据权利要求4所述的筛选方法，其特征在于，所述步骤(a)预处理的步骤为：将混合液沉淀蛋白后，提取上清并干燥，随后用甲醇溶液复溶后离心，取上清得到待测样本。6.根据权利要求4所述的筛选方法，其特征在于，所述步骤(b)具体包括如下步骤：步骤(Ⅰ)：称取甘氨鹅脱氧胆酸钠硫酸钠、甘氨鹅脱氧胆酸、甘氨脱氧胆酸、甘氨胆酸和牛磺鹅脱氧胆酸标准品，用甲醇溶解，得到不同...

【专利技术属性】
技术研发人员：童鸿斌，叶剑，
申请(专利权)人：杭州汉库医学检验所有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江,33