一种溶酶体内酸性水解酶活性的检测方法和检测试剂盒技术

本发明专利技术属于生化分析检测技术领域，具体为溶酶体内酸性水解酶活性的检测方法和检测试剂盒。本发明专利技术首先设计包含5种溶酶体内粘多糖酸性水解酶的检测系统，这五种酶分别为：α‑L‑艾杜糖苷酶、艾杜糖醛酸硫酸酯酶、β‑N‑乙酰半乳糖胺‑6‑硫酸酯酶、β‑半乳糖苷酶和芳基硫酸酯酶B酶。本发明专利技术利用4甲基伞形酮具有荧光的特性，使用化学合成获得的4甲基伞形酮基团与酶底物结合产生的新底物，采用含有新底物的酸性缓冲溶液与粘多糖水解酶进行反应，水解酶水解底物后释放出游离的4甲基伞形酮荧光物质。样本中水解酶的活性越高，水解底物释放的4甲基伞形酮的量越多，通过荧光检测产生的荧光强度也越高，从而实现对水解酶活性的定量检测。本发明专利技术检测灵敏度高、选择性好、抗干扰能力强、可重现性好、操作简便。

A detection method and detection kit for the activity of acid hydrolytic enzyme in the enzyme in vivo

The invention belongs to the technical field of biochemical analysis and detection, in particular, a detection method and a detection kit for the activity of acid hydrolytic enzyme in the enzyme in vivo. The detection system of the present invention first design consists of 5 kinds of lysosomal acid mucopolysaccharide hydrolase, these five enzymes are: alpha L l-iduronidase enzyme, iduronate sulfatase, beta N acetylgalactosamine 6 sulfatase, beta galactosidase and aryl sulfate enzyme B. The present invention utilizes 4 methyl umbelliferone with fluorescent properties obtained using chemical synthesis of 4 methyl propyl ketone groups and enzyme substrate binding substrate to produce new, with new substrate in acidic buffer solution and mucopoly glucohydrolase reaction, after the release of the 4 substrate hydrolyzed methyl umbelliferone fluorescent substance free. The higher the activity of hydrolase in the sample, the more the amount of the 4 methyl umbrella ketone released from the substrate, the higher the fluorescence intensity produced by fluorescence detection, so as to achieve quantitative detection of the activity of the hydrolase. The invention has high detection sensitivity, good selectivity, strong anti-interference ability, good reproducibility and easy operation.

【技术实现步骤摘要】
一种溶酶体内酸性水解酶活性的检测方法和检测试剂盒
本专利技术属于生化分析检测
，具体涉及溶酶体内酸性水解酶活性的检测方法和检测试剂盒。
技术介绍
水解酶是催化水解反应的一类酶的总称，广泛分布于人体，对人体新陈代谢以及生物调控等生命活动起着重要作用。溶酶体是细胞中富含多种高浓度酸性水解酶的泡状细胞器，是负责细胞内各种物质分解和消化的重要细胞器。而由于溶酶体酶活性缺失所引起的一系列遗传性代谢性疾病被统称为溶酶体病，而目前临床上常说的溶酶体病主要特指先天性溶酶体病(CongenitalLysosomalDisease)。溶酶体病的发生是由于溶酶体内一种或多种酶的缺陷，导致其代谢物在组织器官内贮积，故又被称为溶酶体贮积症(LysosomalStorageDisorders)。因此溶酶体水解酶活性的检测在溶酶体病的筛查诊断和预后等方面都有很重要的意义。其中粘多糖贮积症(Mucopolysaccharidoses，MPS)是我国最常见的一组进行性粘多糖代谢障碍遗传病，占比高达40%。粘多糖贮积症根据缺陷酶的不同可以被分为7型：分别是I、II、III、IV、VI、VII和IX型，其中Ⅲ型被分为ⅢA,ⅢB,ⅢC,ⅢD四个亚型，Ⅳ型又被分为ⅣA和ⅣB两个亚型，虽然各型致病基因和临床表现有差异，但由于贮积的底物都是粘多糖因此统称为粘多糖贮积症。其中粘多糖贮积症II型属于X连锁隐性遗传病，而其他类型均为常染色体隐性遗传。粘多糖贮积症最早是由Brante通过组织化学分析提出。但事实上，早在1917和1919年Hunter和Hurler便已发表相关的临床表现的描述，但是由于其病因一直未明，直至70年代初才确认其属于溶酶体贮积症。其中的MPSII型为分布仅次于戈谢病的疾病，是我国的第二高发的单个溶酶体贮积症（20%）。此外，MPSI型和MPSIV型也是中国人群中较为常见的粘多糖贮积症类型。此组疾病最常见的表现主要为面容粗陋、骨骼异常、伴或不伴有智力落后等，是我国认识和研究稍多的一组疾病。由于酶具有高度专一的催化活性，故可通过测定其相应的底物或产物浓度变化进而实现对酶活性的检测。目前对于水解酶活性的检测国内外多采用荧光分析法和比色分析法，比色法多以对硝基苯磷酸二纳为显色底物，由于底物在碱性磷酸酶的催化作用下水解生成黄色的末端产物，并且在405nm处有最大吸收峰，从而实现对碱性磷酸酶活性的定量比色分析，但是该方法存在灵敏度低，检测范围窄和抗干扰能力弱等缺点，且底物的稳定性差，易结晶，在光照条件下易分解导致“假阳性”结果。而荧光底物稳定性强，荧光检测具有灵敏度强、特异性高、抗干扰能力强等特点。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种成本低、效率高、稳定性高、抗干扰能力强的能够快速检测溶酶体内酸性水解酶活性的方法及试剂盒。本专利技术提出的溶酶体内酸性水解酶活性的检测方法，包括以下步骤：将含有4甲基伞形酮荧光基团的底物溶液与待测水解酶溶液孵育，水解酶水解底物释放出荧光基团；对于硫酸酯酶，将其水解有机硫酸酯底物使之游离出无机硫酸后形成一个新的不含硫酸基团的底物化合物，该底物可以被另一种水解酶水解，通过添加一定量的水解酶，水解新形成的底物，释放荧光基团；测定反应在355nm处激发光下460nm出的发射光强度；根据荧光强度与荧光物质浓度的标准曲线关系，计算得到荧光物质浓度，通过荧光物质浓度与酶活性之间的标准曲线关系，计算得到待测水解酶溶液中水解酶的活性。具体来说，本专利技术提出的检测溶酶体内酸性水解酶活性的方法，具体步骤如下：（1）将含有4甲基伞形酮荧光基团的底物溶液（PH为3.5-5.5）与待测水解酶溶液在37℃恒温条件下孵育1-17小时；底物经水解酶水解后释放出荧光基团产生荧光，测定反应在355nm处激发光下460nm处的发射光强度；（2）根据荧光强度与荧光物质浓度的曲线关系，计算得到荧光物质浓度，荧光标准曲线使用标准荧光物质4甲基伞形酮进行浓度梯度稀释后（0-10nmol/ul，优选1-10nmol/ul）进行荧光检测，通过标准物质浓度梯度与荧光强度进行线性分析计算获得标准曲线方程；（3）根据荧光物质浓度与酶活性之间的曲线关系，计算得到待测水解酶溶液中水解酶的活性，待测样本经荧光检测获得荧光强度，荧光强度数值通过荧光强度与荧光物质浓度的标准曲线方程计算出荧光物质浓度，通过荧光物质的摩尔浓度可以计算出被水解底物的摩尔浓度，计算单位时间内单位浓度蛋白中水解酶水解底物的量来代表酶活性数值；检测溶酶体内酸性硫酸酯酶活性的方法，具体步骤如下：（1）将含有4甲基伞形酮荧光基团的底物溶液（PH3.5-5.5）与待测水解酶溶液在37℃恒温条件下孵育4-17小时，其水解有机硫酸酯底物使之游离出无机硫酸后，形成一个新的不含硫酸基团的底物化合物；在反应体系内补充5-10ul人重组α-L-艾杜糖苷酶溶液（浓度为500-1000ng/ul）或β-半乳糖苷酶溶液（浓度为0.01-0.1U/ul）继续37℃恒温条件下孵育2-24小时，水解硫酸酯酶酶水解后的底物化合物并释放出荧光基团产生荧光；测定反应在355nm处激发光下460nm处的发射光强度；（2）根据荧光强度与荧光物质浓度的曲线关系，计算得到荧光物质浓度，荧光标准曲线使用标准荧光物质4甲基伞形酮进行浓度梯度稀释后（0-10nmol/ul，优选1-10nmol/ul）进行荧光检测，通过标准物质浓度梯度与荧光强度进行线性分析计算获得标准曲线方程；（3）根据荧光物质浓度与酶活性之间的曲线关系，计算得到待测水解酶溶液中水解酶的活性，待测样本经荧光检测获得荧光强度，荧光强度数值通过荧光强度与荧光物质浓度的标准曲线方程计算出荧光物质浓度，通过荧光物质的摩尔浓度可以计算出被水解底物的摩尔浓度，计算反应时间内单位浓度蛋白中水解酶水解底物的量来代表酶活性数值。本专利技术中，检测溶酶体酶活性的具体计算如下：检测读取的待测样本荧光值为F样，实验中空白对照（即用纯化水代替样本）的荧光值为F空，反应生成荧光物质的量为C，检测体积为V检，反应体积为V，蛋白质量为M。假设荧光标准曲线的线性方程为Y=a*X+b，其中Y为荧光物质的量，X为荧光强度读数，a和b为常数。公式1：；公式2：。说明：此处荧光物质及底物浓度计算均采用摩尔浓度，因此硫酸酯酶或水解酶所水解底物的摩尔浓度与生成的荧光物质的摩尔浓度一致。本专利技术中，所述的水解酶为α-L-艾杜糖苷酶、β-半乳糖苷酶和芳基硫酸酯酶B酶；硫酸酯酶为艾杜糖醛酸硫酸酯酶、β-N-乙酰半乳糖胺-6-硫酸酯酶。其中：所述的水解酶为α-L-艾杜糖苷酶，底物为4-甲基伞形酮-α-L-艾杜糖苷。所述的硫酸酯酶为艾杜糖醛酸硫酸酯酶，底物为4-甲基伞形酮-α-L-艾杜糖醛酸-2-硫酸酯二钠盐。所述的硫酸为β-N-乙酰半乳糖胺-6-硫酸酯酶，底物为4-甲基伞形酮-β-D-半乳糖苷-6-硫酸酯钠盐。所述的水解酶为β-半乳糖苷酶，底物为4-甲基伞形酮-β-D-吡喃半乳糖苷。所述的水解酶为芳基硫酸酯酶B酶，底物为4-甲基伞形酮基硫酸酯钾盐。相应于上述检测方法，本专利技术提供溶酶体内酸性水解酶活性的检测试剂盒，其包括：4-甲基伞形酮-α-L-艾杜糖苷、4-甲基伞形酮-α-L-艾杜糖醛酸-2-硫酸酯二钠盐、4-甲基伞形酮-β-D-半乳糖本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种溶酶体内酸性水解酶活性的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：将含有4甲基伞形酮荧光基团的底物溶液与待测水解酶溶液孵育，水解酶水解底物释放出荧光基团；对于硫酸酯酶，将其水解有机硫酸酯底物使之游离出无机硫酸后形成一个新的不含硫酸基团的底物化合物，该底物用另一种水解酶水解，通过添加一定量的水解酶，水解新形成的底物，释放荧光基团；测定反应在355nm处激发光下460nm出的发射光强度；根据荧光强度与荧光物质浓度的标准曲线关系，计算得到荧光物质浓度，通过荧光物质浓度与酶活性之间的标准曲线关系，计算得到待测水解酶溶液中水解酶的活性。

【技术特征摘要】
1.一种溶酶体内酸性水解酶活性的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：将含有4甲基伞形酮荧光基团的底物溶液与待测水解酶溶液孵育，水解酶水解底物释放出荧光基团；对于硫酸酯酶，将其水解有机硫酸酯底物使之游离出无机硫酸后形成一个新的不含硫酸基团的底物化合物，该底物用另一种水解酶水解，通过添加一定量的水解酶，水解新形成的底物，释放荧光基团；测定反应在355nm处激发光下460nm出的发射光强度；根据荧光强度与荧光物质浓度的标准曲线关系，计算得到荧光物质浓度，通过荧光物质浓度与酶活性之间的标准曲线关系，计算得到待测水解酶溶液中水解酶的活性。2.根据权利要求1所述的溶酶体内酸性水解酶活性的检测方法，其特征在于，具体操作步骤如下：（1）将含有4甲基伞形酮荧光基团的底物溶液与待测水解酶溶液在37℃恒温条件下孵育1-17小时，底物溶液的PH为3.5-5.5；底物经水解酶水解后释放出荧光基团产生荧光，测定反应在355nm处激发光下460nm处的发射光强度；对于硫酸酯酶，将含有4甲基伞形酮荧光基团的底物溶液与待测水解酶溶液在37℃恒温条件下孵育4-17小时，底物溶液的PH为3.5-5.5；其水解有机硫酸酯底物使之游离出无机硫酸后，形成一个新的不含硫酸基团的底物化合物；在反应体系内补充5-10ul浓度为500-1000ng/ul的人重组α-L-艾杜糖苷酶溶液或浓度为0.01-0.1U/ul的β-半乳糖苷酶溶液继续37℃恒温条件下孵育2-24小时，水解硫酸酯酶酶水解后的底物化合物并释放出荧光基团产生荧光；测定反应在355nm处激发光下460nm处的发射光强度；（2）根据荧光强度与荧光物质浓度的曲线关系，计算得到荧光物质浓度，荧光标准曲线使用标准荧光物质4甲基伞形酮进行浓度梯度稀释至0-10nmol/ul，进行荧光检测，通过标准物质浓度梯度与荧光强度进行线性分析计算获得标准曲线方程；（3）根据荧光物质浓度与酶活性之间的曲线关系，计算得到待测水解酶溶液中水解酶的活性，待测样本经荧光检测获得荧光强度，荧光强度数值通过荧光强度与荧光物质浓度的标准曲线方程计算出荧光物质浓度，通过荧光物质的摩尔浓度可以计算出被水解底物的摩尔浓度，计算单位时间内单位浓度蛋白中水解酶水解底物的量来代表酶活性数值。3.根据权利要求2所述的溶酶体内酸性水解酶活性的检测方法，其特征在于，检测溶酶体酶活性的具体计算如下：检测读取的待测样本荧光值为F样，实验中空白对照荧光值为F空，反应生成荧光物质的量为C，检测体积为V检，反应体积为V，蛋白质量为M；假设荧光...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵书民，顾学范，龚虎涛，陈林，周巍，金云舟，
申请(专利权)人：上海五色石医学研究股份有限公司，
类型：发明
国别省市：上海,31