本发明专利技术公开了来自盐芥的一个耐盐、抗旱基因及其编码蛋白。该基因可具有下述核苷酸序列之一：１）序列表中ＳＥＱ ＩＤ №：１的ＤＮＡ序列；２）在高严谨条件下可与序列表中ＳＥＱ ＩＤ №：１限定的ＤＮＡ序列杂交的核苷酸序列。该基因的编码蛋白具有序列表中ＳＥＱ ＩＤ №：２的氨基酸残基序列。本发明专利技术的耐盐、抗旱基因将在培育耐盐性增强的植物（特别是水稻、小麦等农作物）中发挥重要的作用。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及植物中与抗胁迫相关的基因及其编码蛋白与应用，特别涉及盐芥中的一个耐盐、抗旱基因及其编码蛋白与其在培育耐盐、抗旱性提高植物中的应用。
技术介绍
研究表明，拟南芥的一些近亲具有极强的耐逆性，并且较适宜进行遗传操作。其中，盐生植物-盐芥与拟南芥极为相似，基因序列同源性可达70-90％，不仅具有遗传学模式植物令人满意的形态、生长特性及遗传特点，还对海水的高盐浓度具有较强的耐受能力。因此，盐芥不但是一种可供研究植物自然耐盐机制的优异遗传模式植物，更是一种分离优异耐盐、抗旱相关基因的资源植物。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一个盐芥的耐盐、抗旱基因及其编码蛋白。本专利技术所提供的耐盐、抗旱基因，名称为ST6-66，来源于十字花科植物盐芥(Thellungiella halophila)，是下述核苷酸序列之一1)序列表中SEQ ID №1的DNA序列；2)在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID №1限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。所述高严谨条件为在0.1×SSPE(或0.1×SSC)、0.1％SDS的溶液中，65℃条件下杂交并洗膜。序列表中的SEQ ID №1由695个碱基组成，其编码序列为自5’端第50-583位碱基，编码具有序列表中SEQ ID №2的氨基酸残基序列的蛋白质。本专利技术耐盐、抗旱基因所编码的蛋白(ST6-66)，也属于本专利技术的保护范围。它是具有序列表中SEQ ID №2的氨基酸残基序列的蛋白质。序列表中的SEQ ID №2由177个氨基酸残基组成。含有本专利技术基因的表达载体、转基因细胞系及宿主菌均属于本专利技术的保护范围。扩增ST6-66中任一片段的引物对也在本专利技术的保护范围之内。利用植物表达载体，将本专利技术的耐盐、抗旱基因导入植物细胞，可获得对高盐、干旱耐受力增强的的转基因细胞系及转基因植株。所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等。所述植物表达载体还可包含外源基因的3’端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它的可参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3’端，如农杆菌冠瘿瘤诱导(Ti)质粒基因(如胭脂合成酶Nos基因)、植物基因(如大豆贮存蛋白基因)3’端转录的非翻译区均具有类似功能。使用ST6-66构建植物表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型启动子或诱导型启动子，如花椰菜花叶病毒(CAMV)35S启动子、根部特异表达启动子等，它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用；此外，使用本专利技术的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(GUS基因、萤光素酶基因等)、具有抗性的抗生素标记物(庆大霉素标记物、卡那霉素标记物等)或是抗化学试剂标记基因(如抗除莠剂基因)等。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。携带有本专利技术ST6-66的植物表达载体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物细胞或组织培育成植株。被转化的植物宿主既可以是水稻、小麦等单子叶植物，也可以是拟南芥、大豆、油菜等双子叶植物。通过对转化本专利技术所提供的耐盐、抗旱基因ST6-66后所得到的转基因拟南芥植株进行逆境胁迫试验，证明该基因在转入植物后可显著提高植株的耐盐性。本专利技术为人为控制植物中抗逆和耐逆相关基因的表达提供了基础，将在培育抗逆性和耐逆性增强的植物(特别是水稻、小麦、油菜等农作物)中发挥重要的作用。下面结合具体实施例对本专利技术做进一步说明。附图说明图1A为载体pCB2004的物理图谱图1为经100Mm NaCl胁迫处理的ST6-66转化体和野生型拟南芥的生长情况图2为经150Mm NaCl胁迫处理的ST6-66转化体和野生型拟南芥的生长情况图3为经100Mm NaCl、150Mm NaCl胁迫处理的ST6-66转化体和野生型拟南芥的生物量统计结果图4为经100Mm NaCl、150Mm NaCl、165Mm NaCl和180Mm NaCl胁迫处理的ST6-66转化体和野生型拟南芥的成活率统计结果图5A为经含250Mm NaCl的土壤胁迫处理ST6-66转化体和野生型拟南芥在中的生长情况图5B为ST6-66转化体和野生型拟南芥在不含盐的土壤环境中的生长情况图6为分别经含OMm NaCl和含250Mm NaCl土壤处理9天后的ST6-66转化体和野生型拟南芥的莲苔直径统计结果图7为分别经含250Mm NaCl土壤处理后的ST6-66转化体和野生型拟南芥所结的果荚中种子颗粒数的统计结果图8为ST6-66转基因拟南芥和野生型拟南芥在土壤中进行的干旱胁迫20天后植株的生长情况图9为ST6-66转基因拟南芥和野生型拟南芥在土壤中进行的干旱胁迫15天后莲苔直径统计结果图10为ST6-66转基因拟南芥和野生型拟南芥在土壤中进行的干旱胁迫20天后恢复浇水三天后的植株生长情况具体实施方式下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。实施例1、盐芥耐盐基因ST6-66的获得一、盐芥cDNA文库的构建提取盐芥总RNA，反转录得到盐芥全基因组的cDNA，采用高通量构建载体的方法(Gateway Technology)(汪宗桂，郑文岭，马文丽；通路克隆系统DNA重组技术的新进展.中国生物工程杂志(2003)，第23卷第7期)，将盐芥cDNA先重组克隆到pDONR207载体(Invitrogen公司)，得到Entry cDNA文库，然后再以重组克隆将整个cDNA文库穿梭至含有35S启动子的植物过量表达双元载体pCB2004(物理图谱如图1A所示)中，得到盐芥cDNA文库。上述重组反应完全按照Invitrogen提供的实验指南进行。二、将盐芥cDNA文库转化野生型拟南芥将步骤一构建的盐芥cDNA文库穿梭到双元载体pCB2004中，电转化至农杆菌C58，采用拟南芥花序浸花转化的方法(floral dip method)(Steven J.Clough and AndrewE.BentFloral dipa simplified method forAgrobacterium-mediatedtransformation of Arabidopsis thaliana.The Plant JournalVolume 16 Issue6 Page 735-December 1998)大规模转化拟南芥。三、拟南芥耐盐转化体的筛选 1、拟南芥转化体库的创建在土壤中大规模播种步骤二获得的转化有盐芥cDNA文库的拟南芥转化体的种子，在种子发芽后约5天，表面喷洒浓度为0.2％的除草剂(glufosinate ammonium，商用名为Liberty，法国Av本文档来自技高网...
【技术保护点】
盐芥的一个耐盐、抗旱基因，具有下述核苷酸序列之一：１）序列表中ＳＥＱＩＤ№：１的ＤＮＡ序列；２）在高严谨条件下可与序列表中ＳＥＱＩＤ№：１限定的ＤＮＡ序列杂交的核苷酸序列。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：杜金，向成斌，
申请(专利权)人：中国科学技术大学，
类型：发明
国别省市：34[中国|安徽]
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