利用体细胞核转移胚胎作为细胞供体进行附加核转移的方法和系统技术方案

通过核转移方法克隆非人哺乳动物的方法，包括：　　　　（ｉ）获得目的分化的哺乳动物细胞用作供体核的来源；　　　　（ｉｉ）从与供体核来源的细胞同种的哺乳动物中获得至少一个卵母细胞；　　　　　（ｉｉｉ）将所述的至少一个卵母细胞去核；　　　　（ｉｖ）将目的分化的细胞或细胞核转移至去核的卵母细胞；　　　　（ｖ）同时融合和活化细胞偶联体以形成第一转基因胚胎；　　　　（ｖｉ）培养所述的第一转基因胚胎直至达到其至少２细胞发育阶段；且　　　　（ｖｉｉ）利用所述第一转基因胚胎的至少一个细胞作为供体细胞来通过至少另一轮核转移生产第二转基因胚胎产生转基因动物。（*该技术在2023年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及利用体细胞核转移方法产生的胚胎细胞作为供体进行第二轮核转移来产生转基因动物(“再克隆”)的改良方法，特别是非人哺乳动物。更具体地，本专利技术提供了再克隆以提高转基因动物的转基因表达和表达水平的改良方法。
技术介绍
本专利技术主要涉及体细胞核转移(SCNT)领域以及目的转基因动物的建立。更加具体地，它涉及产生体细胞来源的细胞系、转化这些细胞系、并利用这些转化细胞通过一轮以上的核转移来产生转基因非人哺乳动物种类的方法。长久以来人们一直期望具有一定所需的特性或性质，例如增加的体重、奶量、产奶体积、哺乳间隔期以及疾病抵抗力的动物。传统的饲养方法能够生产具有一些特定所需特性的动物，但通常这些特性伴随着一些不需要的性质、耗时、昂贵而不可靠。而且，这些方法根本不能使特定的动物系生产基因产品，例如所需的蛋白治疗剂，从目标物种的遗传补足物中完全缺失(如，牛乳中的蛛丝蛋白)。能够产生转基因动物的技术的建立，提供了一种生产由基因改造携带特定特性或被设计表达某些蛋白或其它分子化合物的转基因动物的异常精确的方法。即，转基因动物为携带发育早期慎重地导入体细胞和/或生殖细胞的基因的动物。随着动物的发育和生长，由基因工程引入动物的蛋白产品或特定的发育改变就显现出来。目前能获得的产生转基因家畜动物的技术效率低且耗时，通常产生极低比例的存活胚胎。在转基因的建立过程中，DNA序列通常随机插入，可能导致一系列的问题。首要问题为插入失活，它是由于编码或调控序列被引入的DNA中断而导致必需基因的失活。另一问题为转基因可能根本不整合，或整合但不表达。另一个问题为由于位置效应导致不精确调控的可能性，这指基因表达水平的可变性和用同一转基因构建体生产的不同建立者(founder)动物之间的基因调控的精确性。因此，产生大量的建立者(founder)动物且经常确定其中少于5％以保障转基因系维持的方式表达转基因并非罕见。另外，产生转基因家畜动物的效率较低，产生的100个后代中只有一个转基因动物的效率并非罕见(Wall，1997)。结果产生转基因动物的花费可以高达每只表达动物25-50万美元(Wall，1997)。现有技术方法已经典型地在克隆程序中应用胚胎细胞类型。这包括Campbell等人(Nature，1996)以及Stice等人(Biol.Reprod.1996)的工作。在这些研究中，胚胎细胞系均来自少于10天妊娠的胚胎。在这两项研究中，细胞都在饲喂层上维持，防止用于克隆步骤的供体细胞的明显分化。本专利技术采用分化细胞。我们认为胚胎细胞类型也可能与从分化供体核起始的克隆胚胎一起用于本专利技术的方法。因此，根据本专利技术，包括羊的哺乳动物的高级基因型的增殖是可能的。这将允许具有被证明的遗传优越性或其它所需特性的成年动物的繁殖。在例如包括山羊、啮齿动物、牛和兔的许多重要哺乳动物物种中的进步将加速。通过本专利技术，可能几十亿胎儿或成年细胞可以被收获并用于克隆程序。这将潜在地在短时期内产生许多同样的后代。因此，尽管已经用多种方法在几个不同物种生产了转基因动物，仍然缺乏以合理的成本容易地和可重复地生产能够大量表达目的蛋白或展示转基因的插入所导致的遗传改变的转基因动物的方法。而且，根据本专利技术，在第一轮克隆中运用体外成熟的卵母细胞，产生2-，4-，8-，16-，32-细胞、桑椹胚和胚泡，并运用这些卵裂球作为供体细胞用体内成熟的卵母细胞再克隆，可节省费用，因为体外成熟的卵母细胞可能比体内产生的卵母细胞便宜。相应地，存在对使建立转基因动物的生产效率提高的改良核转移方法的需要，特别是关于通过采用一轮以上的核转移，建立稳定表达目的转基因的转基因动物的活化。专利技术简述简要地说，本专利技术提供了通过连续的核转移过程克隆非人哺乳动物的方法，包括获得所需的分化哺乳动物细胞用作供体核的来源；从与供体核来源的细胞相同物种的哺乳动物得到至少一个卵母细胞；使该至少一个卵母细胞去核；将所需的分化细胞或细胞核转移到去核的卵母细胞；同时融合和活化细胞偶联体(couplet)以形成第一转基因胚胎，并使其成熟为至少两细胞的阶段；接着采用第一转基因胚胎的至少一个细胞作为供体细胞进行至少另一轮的核转移；培养活化的第二轮胚胎，接着利用产生的细胞或最终将第二转基因胚胎转移到合适的宿主哺乳动物中，因此胚胎发育为胎儿。典型地，上述方法通过利用在所述的分化的哺乳动物细胞或细胞核插入所述的去核的卵母细胞之前插入、去除或改变目的基因的供体细胞核而完成。还应该注意的是采用的卵母细胞优选为在去核之前在体外成熟的事实，但根据本专利技术也可以在体内成熟。还需指出的是本申请也可以用于提高CICM细胞、胎儿或后代的实用性，例如，可以用于细胞、组织和器官移植。通过从动物中取出胎儿或成年细胞并用于克隆过程，当克隆胎儿经过器官形成而进行发育时可从中获得一系列的细胞、组织和可能的器官。也可以从克隆后代中分离细胞、组织和器官。该方法可为多种医学和兽医学治疗，包括细胞和基因治疗提供了“材料”的来源。如果细胞被转移回细胞来源的动物，那么就避免了免疫排斥。因为许多细胞类型可以从这些克隆中分离，用其它的方法学，例如造血嵌合状态可以避免同一物种以及不同物种动物之间的免疫排斥。在优选的实施方案中，本专利技术的方法将通过改良供体细胞的重新编程(reprogramming)而提高核转移的效率，并因此提高能够在早期从单个胚胎产生的胚胎的数目。在本专利技术的另一实施方案中，成熟卵母细胞可以在体外操作，以限制利用来自来源动物的体内卵母细胞的费用，因此提高了与同时利用接受者和体外供体细胞相比的效率。本专利技术方法的另一有益效果为，与从单轮NT的后代相比，通过这些方法的实践，细胞的重新编程(reprogramming)将提高得到的体细胞NT后代的健康状况。本专利技术的另一有益效果是通过利用早期的核转移胚胎细胞作为供体细胞来产生第二代的胚胎，第二代胚胎的重新编程(reprogramming)将被增强。在本专利技术的具体实施方案中，动物为转基因动物，供体核被遗传修饰。供体核可以含有一个或多个转基因，且该遗传修饰可以在核转和胚胎重新构成前发生。优选实施方式说明下列缩写词在说明书中具有指定的意义缩略词表体细胞核转移(SCNT)培养的内细胞团细胞(CICM)核转移(NT)合成的输卵管液(SOF)胎牛血清(FBS)聚合酶链反应(PCR)牛血清白蛋白(BSA)术语解释胚泡-有胎盘哺乳动物的植入子宫前的大约30-150细胞的胚胎(小鼠受精后大约3天，人受精后大约5天)。胚泡期在桑椹胚期之后，可以通过它独特的形态学进行区分。胚泡包括由细胞层(滋养外胚层)、充满液体的腔(囊胚腔或胚泡腔)和内部的细胞簇(内细胞团或ICM)组成的球体。ICM由未分化细胞组成，如果胚泡植入子宫，它提供将变为胎儿的物质。这些同样的ICM细胞，如果在培养基中生长，可以产生胚胎干细胞系。在植入时，小鼠胚泡由大约70个滋养层细胞和30个ICM细胞组成。囊胚-用于形容胚胎发育的早期阶段的术语，由中空的细胞球密封被称为囊胚腔的充满液体的空腔组成。术语囊胚有时可与胚泡互换使用。羊-不同种类山羊的或与之相关的事物。细胞偶联体-融合和/或活化之前的去核的卵母细胞和体细胞或胎的细胞核。卵裂型-极早期胚胎分裂中的细胞的分裂模式；每一物种的生物体表现出可本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】

【专利技术属性】
技术研发人员：E·贝布迪，E·梅米利，Y·艾彻拉德，
申请(专利权)人：GTC生物治疗学公司，
类型：发明
国别省市：