高纯度蛇毒激肽原酶的制备方法及其药物制剂技术

本发明专利技术涉及制备高纯度蛇毒激肽原酶的方法，将抗原抗体反应与亲和层析技术结合，从含蛇毒激肽原酶的原料蛇毒中将蛇毒激肽原酶分离纯化，制备得到纯度高的蛇毒激肽原酶。本发明专利技术还涉及通过本发明专利技术方法制备的高纯度蛇毒激肽原酶及其药物制剂，获得的产品比活高、纯度高，不含或仅含少量杂质，使用安全，能达到静脉给药的要求。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及高纯度蛇毒激肽原酶的制备方法，具体地说涉及采用免疫亲和层析法制备的高纯度蛇毒激肽原酶。本专利技术还涉及采用本专利技术方法制备的高纯度蛇毒激肽原酶及其制剂。
技术介绍
激肽原酶是动物体内的一种蛋白水解酶，存在于许多器官的组织中。人们认识最早、研究最为清楚的是蛇毒脏中的胰激肽原酶。胰激肽原酶(Pancreatic Kallidinogenase)又称为胰激肽释放酶(Pancreatic Kallikrein)是一类内切型蛋白水解酶，存在于哺乳动物体内的多种组织，尤以蛇毒脏中含量最为丰富。在体内作用于激肽原，使其释放出激肽，从而发挥出一系列的药理作用使微血管扩张，改善外周血液循环；促进前列腺素分泌，扩张小动脉，增加肾血管流量；激活纤溶酶系统，使纤维蛋白水解，降低血液粘度，防止血栓形成，溶解血栓。临床上主要用于微循环障碍引起的肾病变及眼底供血障碍、高血压症、脑动脉硬化和脑动脉血栓、冠心病及其它闭塞性周围血管性疾病的治疗。但是蛇毒激肽原酶制剂，由于纯度较低，安全上的限制只能用于口服和肌内注射，使其应用范围、适应症及其疗效受到很大限制。
技术实现思路
本专利技术的一个目的在于提供一种高纯度蛇毒激肽原酶的制备方法，利用免疫亲和层析法制备得到了高纯度的蛇毒激肽原酶。本专利技术的另一目的在于提供使用本专利技术方法制备的高纯度蛇毒激肽原酶。本专利技术的再一目的在于提供含有本专利技术的高纯度蛇毒激肽原酶的药物制剂。根据本专利技术的一方面，制备高纯度蛇毒激肽原酶的方法，包括下述步骤1)将含蛇毒激肽原酶的蛇毒原料初步纯化、分离，获得主要成分为蛇毒激肽原酶的活性组分1；2)将所述活性组分1进一步纯化，获得活性组分2；3)以所述活性组分2作为抗原，制备抗蛇毒激肽原酶特异性抗体；4)将所述制备得到的抗蛇毒激肽原酶特异性抗体与亲和层析载体结合，制备抗体亲和层析柱；5)以所述抗体亲和层析柱分离纯化步骤1)中的活性组分1，获得高纯度蛇毒激肽原酶。本专利技术的方法中，将抗原抗体反应与亲和层析技术结合，从含蛇毒激肽原酶的原料蛇毒中将蛇毒激肽原酶分离纯化，制备得到纯度高的蛇毒激肽原酶。该方法中，首先需制备获得针对蛇毒激肽原酶的特异性抗体，再将该特异性抗体与适宜的亲和层析载体结合，制备成抗体亲和层析柱，利用该抗体亲和层析柱可对原料进行纯化，制备高纯度的蛇毒激肽原酶。在本专利技术方法中，针对蛇毒激肽原酶的特异性抗体可以采用多种方法制备，在本专利技术的一个具体实施方案中，首先以蛇毒激肽原酶为抗原免疫小鼠，获得含抗蛇毒激肽原酶抗体的小鼠抗血清，同时将该蛇毒激肽原酶与亲和层析载体结合，制备成抗原亲和层析柱，将小鼠抗血清上抗原亲和层析柱，利用结合于亲和层析载体上的抗原蛋白与血清中的抗体特异结合，获得纯化的特异性抗体。此外，也可以采用单克隆抗体技术来制备本专利技术的蛇毒激肽原酶的特异性抗体，例如，将经蛇毒激肽原酶免疫后的小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞融合，获得杂交瘤细胞，筛选分泌蛇毒激肽原酶抗体的杂交瘤细胞建株，由此可获得稳定的蛇毒激肽原酶的特异性抗体。将制备获得的抗蛇毒激肽原酶特异性抗体与适宜的亲和层析载体结合，制备成抗体亲和层析柱，使用该抗体亲和层析柱即可对原料进行分离纯化，制备高纯度的蛇毒激肽原酶。在本专利技术方法中，为了获得高纯度的蛇毒激肽原酶，可以采用对原料进行分步纯化的方法，例如，在本专利技术的一个具体实施方案中，首先将原料蛇毒进行透析截留一定分子量的成分，然后将获得的样品通过离子交换层析进行初步纯化，获得活性组分1，该活性组分1再经本专利技术的抗体亲和层析柱纯化，即可获得高纯度的蛇毒激肽原酶。用作抗原的蛇毒激肽原酶最好使用纯度较高的蛇毒激肽原酶，在本专利技术方法中，该用作抗原的蛇毒激肽原酶可以通过将上述初步纯化的活性组分1进一步经过制备型高效液相色谱的分离而获得，这样获得的蛇毒激肽原酶(活性组分2)可以用作免疫小鼠的抗原和制备抗原亲和层析柱的抗原使用。本专利技术方法中用作亲和层析柱的载体的材料可以使用各种适宜的载体材料，优选的载体材料可以使用多糖基质，例如Sepharose 4B琼脂糖凝胶、二乙氨基葡聚糖凝胶或羧甲基葡聚糖凝胶，在使用前可以先将载体活化，本专利技术的实施方案中，使用溴化氰作为活化剂，将制备得到的抗原或特异性抗体偶联到活化了的载体上，即可制备抗原亲和层析柱与抗体亲和层析柱。根据本专利技术的另一方面，提供通过本专利技术方法制备的高纯度蛇毒激肽原酶，其具有以下特性比活性为每毫克蛋白800单位以上；高效液相色谱法检测，单组分图谱，主峰面积大于95％，保留时间为7.8±0.5min；SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳上显示一条带，分子量为34～44千道尔顿；氨基酸序列分析，N-末端15个氨基酸序列为Val-Ile-Gly-Gly-Asp-Glu-Cys-Asn-Ile-Asn-Glu-His-Arg-Phe-Leu。根据本专利技术的再一方面，提供含有本专利技术高纯度蛇毒激肽原酶的药物制剂，以本专利技术的高纯度蛇毒激肽原酶为药效成分，添加药学上可接受的药用辅料制备得到适于临床应用各种药物制剂，这些制剂的剂型包括但不限于片剂、胶囊剂、小容量注射剂、冻干粉针剂及专供静脉注射和静脉滴注用的大输液或冻干制剂。例如，注射用蛇毒激肽原酶(冻干静脉注射用蛇毒激肽原酶)、蛇毒激肽原酶注射液(静脉注射用蛇毒激肽原酶)、蛇毒激肽原酶肠溶胶囊以及蛇毒激肽原酶肠溶片等。本专利技术采用免疫亲和层析技术，从蛇毒中提取的激肽原酶纯度高，获得的产品比活高、纯度高，不含或仅含少量杂质，使用安全，能达到静脉给药的要求。与口服与肌注给药相比，静脉给药可使药品的有效成分全部直接进入血液，缩短吸收过程并减少损耗，因而药效迅速，疗程缩短，减少患者的痛苦并能节省医药费用；尤其适用于急性心脑血管栓塞性疾病的抢救，可以赢得宝贵的救治时间，提高治愈率减少病死率。本专利技术高纯度蛇毒激肽原酶的开发扩大了该品的适应症与使用范围。附图的简要说明附图说明图1为本专利技术方法中制备活性组分1的阴离子交换柱层析紫外吸收图谱；图2为本专利技术方法中抗蛇毒激肽原酶特异性抗体纯化过程记录仪图谱；图3为本专利技术方法中制备高纯度蛇毒激肽原酶的亲和层析流程记录仪图谱；图4为本专利技术高纯度蛇毒激肽原酶SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳图谱；图中泳道1、2、4、5、6、7、9、10为蛇毒激肽原酶；泳道3、8为低分子量标准蛋白(其组成为兔磷酸化酶B97400，牛血清白蛋白66200，兔激动蛋白43000，牛碳酸酐酶31000，胰蛋白酶抑制剂20100，鸡蛋清溶菌酶14400)图5为本专利技术制备的高纯度蛇毒激肽原酶高效液相色谱图谱；图6为本专利技术制备的另一批次的高纯度蛇毒激肽原酶高效液相色谱图谱；图7为本专利技术制备的又一批次的高纯度蛇毒激肽原酶高效液相色谱图谱。专利技术的具体实施例方式高纯度蛇毒激肽原酶的制备1、蛇毒粗品的处理准确称取蝮蛇蛇毒(辽宁清源蛇厂生产)，用0.02mol/L PH7.8的Tris-HCl缓冲液将其溶解提取，然后以4000r/min离心20分钟取上清，沉淀用少量的缓冲液再次离心取上清，合并上清液装透析袋(截留分子量10000以上的组分)在0.02mol/L PH7.8的Tris-HCl缓冲液透析12小时待上样。2、离子交换层析初步纯化样品透析完以后以6.0ml/min的流速上阴离子交换柱(DEAE-Sepharose)本文档来自技高网...

【技术保护点】
制备高纯度蛇毒激肽原酶的方法，包括下述步骤：　　　　１）将含蛇毒激肽原酶的蛇毒原料初步纯化、分离，获得主要成分为蛇毒激肽原酶的活性组分１；　　　　２）将所述活性组分１进一步纯化，获得活性组分２；　　　　３）以所述活性组分２作为抗原，制备抗蛇毒激肽原酶特异性抗体；　　　　４）将所述制备得到的抗蛇毒激肽原酶特异性抗体与亲和层析载体结合，制备抗体亲和层析柱；　　　　５）用所述抗体亲和层析柱分离纯化步骤１）中的活性组分１，获得高纯度蛇毒激肽原酶。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：马骉，魏化伟，吴丹，
申请(专利权)人：北京赛生药业有限公司，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]