产生活性氧类的抗体的抗微生物活性制造技术

基本上由能够结合微生物的抗体和可药用载体组成的抗微生物组合物，其中当存在单线态氧（［１］↑Ｏ↓［２］）时抗体能够产生活性氧类。（*该技术在2023年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及抗体介导的从单线态氧(singlet oxygen)产生活性氧类并涉及治疗组合物和通过使用此类抗体治疗微生物感染的方法。背景整个上世纪的研究已经形成了关于抗体在免疫系统中的作用的一致认识。该认识的本质是抗体分子不直接杀死其靶标或者产生能够逆向影响其靶标的产物。相反，抗体分子已经被当作一种结合分子，它仅标记其靶标或者仅活化其它分子或者活化生物系统以应答抗体-抗原复合体。因此，已经认为抗体自身不具有任何破坏能力而仅用来标记外源物质以通过补体积联反应和/或吞噬作用进行去除(Arlaud等，Immunol.Today，8，106-111(1987)；Sim和Reid，Immunol.Today，12，307-311(1991))。然而，具有催化活性能够直接破坏其靶标的抗体将可用于许多应用，例如，用于直接杀死微生物。专利技术概述本专利技术提供了利用最新发现的抗体产生活性氧类的能力的方法。根据本专利技术，抗体能够通过将单线态氧(1O2*)转化为活性氧类而杀死微生物。抗体实现此种转化不需要免疫系统的任意其它成分，也就是说，不需要补体积联反应或吞噬作用。因此，根据本专利技术，作为产生强活性氧类的结果抗体具有抗微生物活性，强活性氧类包括但不限于超氧自由基(O2-)、羟自由基(OH●)、过氧化氢H2O2或臭氧(O3)。此种活性存在于抗体和抗体覆盖的哺乳动物粒性白细胞例如嗜中性粒细胞。因此，本专利技术针对基本上由可药用载体和能够结合至微生物的经分离抗体组成的抗微生物组合物，其中当存在单线态氧(1O2)时抗体能够产生活性氧类。抗微生物组合物也能够包含能够产生单线态氧(1O2)的敏化分子。在一些实施方案中，当存在光时此类敏化剂能够产生单线态氧(1O2)。敏化分子的例子包括蝶呤、黄素、血卟啉、四(4-磺化苯基)卟啉、二吡啶基钌(II)复合体、玫瑰红染料、醌、若丹明染料、酞菁、竹红菌甲素(hypocrellin)、玉红花青苷(rubrocyanin)、喹哪啶蓝(pinacyanol)、别花青苷(allocyanin)或二氢卟酚(chlorin)。此类敏化分子能够附着至抗体上。在一些实施方案中，抗体是人抗体或人源化抗体。由本专利技术抗体产生的活性氧类包括超氧自由基、羟自由基、过氧化氢、臭氧和其它活性氧类。在一些实施方案中，活性氧类是臭氧。本专利技术还提供了利用抗体从单线态氧产生活性氧类以治疗感染、疾病以其它疾病的方法。本专利技术还涉及包含能够抗击微生物感染的抗体组合物的治疗组合物。此类抗体组合物能够设计成呈现增强的氧化功能。例如，在一些实施方案中，本专利技术针对在哺乳动物中治疗微生物感染的方法，该方法涉及将基本上由能够结合至微生物的抗体和可药用载体组成的抗微生物组合物施用于哺乳动物，其中当存在单线态氧(1O2)时抗体能够产生活性氧类。该组合物也能够包含能够产生单线态氧(1O2)的敏化分子。如上所述，此类敏化分子能够附着至抗体上。在其它实施方案中，本专利技术针对产生活性氧类以抑制微生物生长的方法，该方法涉及将微生物与能够结合到微生物上的抗体和单线态氧(1O2)源相接触。在一些实施方案中，单线态氧(1O2)源是敏化分子。如上所述，此类敏化分子能够附着至抗体上。附图简述附图说明图1图解说明吞噬细胞的氧依赖性杀微生物作用。标出了1O2和O2●-的互变。图2图解说明参与除臭剂红(amplex red)测定的化学转化步骤。抗体(在该图式附图中鉴定为IgG)将1O2转化为O2●-，O2●-能够自发形成过氧化氢。存在辣根过氧化物酶时，过氧化氢脱乙酰化并氧化除臭剂红底物，从而产生在587nm处发射荧光的分子。图3显示存在(□)或缺乏(△)鼠单克隆抗体IgG EP2-19G2(20μM)时PBS(pH 7.4)中H2O2产生的最初时间过程。误差线表示数据偏离平均值的范围。图4显示紫外线照射后鼠抗体1D4 Fab片段单晶体的荧光显微照片和使用除臭剂红试剂检测H2O2。图5说明抗体-介导的活性氧类催化作用的时间过程和所需要的反应条件。图5A提供了当存在(○)或缺乏(◆)31127抗体(马IgG，20μM)时，使用血卟啉(40μM)和可见光在PBS(pH 7.4)中形成H2O2的时间过程。图5B提供了当存在31127抗体(马IgG，6.7μM)时在无添加物的PBS(pH 7.4)(□)或含NaN3的PBS(pH7.4)(O，100μM)或PBS(pH7.4)的D2O溶液(◇)中使用血卟啉(40μM)和可见光产生H2O2的时间过程。图5C图解说明了抗体蛋白质浓度(31127，马IgG)对H2O2形成速率的影响。图5D图解说明氧浓度对通过31127抗体(马IgG，6.7μM)产生H2O2的速率的影响。全部点为至少两次重复测定的平均值。误差线是实验测量值偏离平均值的范围。图6是显示所测得的一组蛋白质的最初H2O2形成速率的条形图并与抗体相比较(数据来自表1)。全部点为至少两次重复测定的平均值。误差线是实验测量值偏离平均值的范围。OVA，鸡蛋卵清蛋白；SOD，超氧化物歧化酶。图7A说明PBS(pH 7.4)中UV照射马IgG(6.7μM)H2O2的形成速率。图7B说明与H2O2形成测量同时进行马IgG在326nm(激发＝280nm)处的荧光发射。图8表明在多种条件下通过抗体生产H2O2。图8A说明通过免疫球蛋白和非免疫球蛋白的H2O2的产生。测定是通过对透照灯(Fischer Biotech)上的密封玻璃瓶管内磷酸缓冲盐(PBS)中的单种抗体/蛋白质样品(100μL，6.7μM)在20EC的环境氧条件下进行近紫外照射(312nm，800μWcm-2)来实现的。在整个测定过程中以一定的时间间隔取出个等份(10μL)。通过除臭剂红方法测定H2O2浓度。每个数据点报道为至少两次重复测量的平均值±SEM●多克隆(poly)免疫球蛋白(Ig)G，人；○ poly-IgG，马；□poly-IgG，绵羊；单克隆(m)IgG(WD1-6G6)，鼠；△ poly-IgM，人；◇ mIgG(92H2)，鼠；■β-半乳糖苷酶(β-gal)；▲鸡卵清蛋白(OVA)；α-乳清蛋白(α-lact)；◆牛血清清蛋白(BSA)。图8B说明通过绵羊poly-IgG(6.7μM，200μL)长期产生H2O2。在96-孔石英板的一个密封孔内的PBS中近紫外照射8小时。H2O2浓度如图8A所述进行测定。图8C表明过氧化氢酶随着时间对抗体催化的H2O2产生的影响。鼠单克隆抗体PCP-21H3(IgG)(6.7μM，200μL)溶液，在96-孔石英板的一个密封孔内的PBS中被照射510分钟。通过除臭剂红方法测定H2O2并且然后通过加入固化于Eupergit C上的过氧化氢酶(10mg，288mU)将H2O2破坏掉。通过过滤将过氧化氢酶去除并将抗体溶液再次照射420分钟。形成速率(0-510分钟)＝0.368μM分钟-1(r2＝0.998)；形成速率(511-930分钟)＝0.398μM分钟-1(r2＝0.987)。图8D表明H2O2浓度对马poly-IgG抗体催化的最大形成速率百分比的影响。此图可以确定H2O2对马poly-IgG光致H2O2产生的IC50。用多种浓度H2O2(0-450μM)孵育马IgG溶液(本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】

【专利技术属性】
技术研发人员：P·温特沃斯，R·A·莱纳，
申请(专利权)人：诺瓦提斯公司，斯克里普斯研究所，
类型：发明
国别省市：