一种用于分离抗栓物质的定向进化方法及其分离的抗栓物质与纯化方法技术

本发明专利技术公开了一种用于分离抗栓物质的定向进化方法及其分离的抗栓物质与纯化方法。本发明专利技术通过构建酵母α交配因子前导肽与部分随机肽的融合ＤＮＡ片段；插入双酶切并用碱性磷酸酶处理的含有诱导型启动子的穿梭载体；电激转化大肠杆菌，提取质粒后电激转化酿酒酵母；转接转化子至棉子糖／半乳糖液体诱导培养基；取诱导了７天的培养物，离心取上清；做抑制凝血酶试验，筛选阳性转化子。本发明专利技术的定向进化方法能简单、高效地发现抗栓肽；这将为抗栓药物和其它药物开发开辟新途径。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物
，具体的说涉及一种定向进化方法及其分离的抗栓物质和初步纯化方法。
技术介绍
血栓会导致冠心病和卒中。冠心病和卒中是当今世界人类非自然死亡的主要病因之一。在我国，每年因此死亡的的病人达二百万左右，占我国所有疾病总死亡人数的31％(中华人民共和国卫生部，2003年中国卫生统计提要)。因此而出现后遗症的人数更多，给患者及其家属造成了巨大的痛苦和经济负担。随着生活压力及生活方式的改变以及社会的日趋老龄化，这类疾病的发病率还有逐年增长的趋势。血栓栓塞导致器官衰竭或功能障碍、致残、丧失工作能力、甚至死亡。如房颤病人每年发生脑部血栓栓塞的危险为5％左右，房颤导致的血栓占脑梗塞的10％-15％，房颤后脑卒中具有更高的致死率和致残率。寻找显效的抗血栓药物日益受到各国卫生界的重视。分离肽类药物或肽类先导化合物是医药研究的重点之一，其主要研究方法包括噬菌体显示及相关方法、全自动化学合成等。前者有一定局限，后者比较昂贵，一般实验室不具备相应的设施和足够的经费。如果能在生物体系合成寡肽和小肽，则能大大缩小成本。现有的定向进化方法一般要求对较大的基因进行操作。一般生物可及性好的药物分子量都在几百道尔顿。如能建立高效的小肽定向进化技术，则能开发更多的功能小肽。
技术实现思路
本专利技术的目的在于针对上述现有定向进化方法存在的问题，提供一种高效的小肽定向进化方法。本专利技术的另一个目的是提供利用上述定向进化方法分离得到的抗栓物质。本专利技术的另一个目的是提供上述抗栓物质的初步纯化方法。本专利技术的目的是通过以下技术措施实现的 (1)构建酵母α交配因子前导肽与部分随机肽的融合DNA片段；用于部分随机肽的分泌表达；(2)插入双酶切并用碱性磷酸酶处理的含有诱导型启动子的穿梭载体；(3)穿梭载体电激转化大肠杆菌，提取质粒后电激转化酿酒酵母；(4)转接转化子至棉子糖/半乳糖液体诱导培养基，诱导培养；(5)取培养物，离心取上清，调pH至中性，加入凝血酶，混匀；1分钟后加入纤维蛋白原，混匀；取无沉淀产生、沉淀量少或产生沉淀时间相对长的活性转化子；上述步骤(2)所述的双酶切为用EcoR I和Xba I双酶切。上述步骤(2)所述的穿梭载体为酿酒酵母穿梭载体。上述步骤(4)所述的诱导培养为在30℃下，摇床诱导培养7天；从酵母阳性转化子扩增插入片段，测序，或用提取的酵母质粒电激转化大肠杆菌，测序。本专利技术方法适用于分离各种抗栓肽，酵母α交配因子前导肽与部分随机肽的融合DNA片段分泌表达后有一个Kex2蛋白酶酶切位点，将切下部分随机肽，分泌至胞外。本专利技术分离得到1个抗栓物质为DNA序列为TCCTGAGATTTTGAAGAAACGCCAGAAGAATATTTGTGA，第二个密码子为终止密码子，氨基酸序列为Ser，为丝氨酸，其具有一个潜在的糖基化位点，在酵母表达时Ser的羟基通常发生甘露糖糖基化。酵母分泌的肽一般在丝氨酸等位点进行糖基化修饰。上述DNA序列具有水蛭素C端12肽的部分随机化片段的非随机部分。但由于第二个密码子为终止密码子，因此TGA后面水蛭素C端12肽片段没有表达。本专利技术方法分离所得的1个抗栓物质可作为药物开发的先导化合物。上述分离得到的抗栓物质的纯化方法，包括如下步骤(1)将强酸性苯乙烯系阳离子树脂置于交换柱内，用酸液浸泡，流出酸液，用无离子水洗至中性；(2)用碱液浸泡，流出碱液，用无离子水洗至中性；(3)加入活性转化子诱导液，静置，滤去诱导液；(4)加入双蒸水洗脱，静置，分管收集洗脱液。上述步骤(1)为将强酸性苯乙烯系阳离子树脂置于交换柱内，用10％的盐酸液浸泡24小时，流出酸液，用无离子水洗至中性。上述步骤(2)为用10％氢氧化钠溶液浸泡24小时，流出碱液，用无离子水洗至中性。上述步骤(3)或步骤(4)所述的静置的时间为30分钟。本专利技术所公开的新的定向进化方法包括以下具体步骤(1)构建酵母α交配因子前导肽与部分随机肽的融合DNA片段，用于部分随机肽的分泌表达。用具有高保真活性的Pfu DNA聚合酶、Pyrobest DNA聚合酶或其它具有高保真活性的热稳定的DNA聚合酶扩增，扩增模板为质粒pPICZαA(质粒pPICZαA含酵母α交配因子前导肽DNA序列，Invitrogen产品)，扩增产物用乙醇沉淀；电吹风吹干；悬浮在无菌蒸馏水里；用EcoR I和Xba I双酶切6小时至过夜；70℃热失活。(2)用EcoR I和Xba I双酶切pYES2/CT(Invitrogen产品)过夜，同时加碱性磷酸酶CIP脱5’磷酸。70℃热失活20分钟。取双酶切的pYES2/CT，加入双酶切的PCR产物，16℃连接过夜。乙醇沉淀和70％乙醇洗涤后电激转化大肠杆菌。涂板，于30℃生长，略有毒性的基因在此温度下会因其毒性降低而提高质粒产量。(3)提取大肠杆菌质粒，加RNase消化RNA。限制性内切酶Nde I和NotI酶切鉴定，空载体切出两个条带，有插入片断的质粒切出一个6.1kb的条带。质粒经乙醇沉淀和70％乙醇洗涤后取10μl准备做酵母电激。(4)首先制备酵母感受态细胞。将在30℃摇床培养到OD值1.3-1.5的酿酒酵母菌离心，去上清；重悬在醋酸锂/二硫苏糖醇预处理液中，20-30℃保温1小时；用冰预冷的无菌水洗涤两次；再用冰预冷的1mol/L山梨醇中洗涤一次；重悬于0.2-0.5ml冰预冷的1mol/L山梨醇中，冰浴；每个无菌管中加80μl酵母悬浮液和100ng的DNA(总体积为10μl)及20μg ssDNA(鲑鱼精DNA)，轻轻混匀，转移至0.2-cm无菌电激杯，10℃水浴5分钟。1.8千伏、25微法、200欧姆做电激。立刻加入650μl 1mol/L山梨醇到电激杯中。轻轻混匀，转移到培养管，加650μl 2X YPD/1mol/L山梨醇，混匀之后30℃摇床培养1小时。(5)将电激混合物涂布葡萄糖/山梨醇选择平板，于30℃生长3天；(6)接转化子和对照(仅含有空载体的转化子)至棉子糖/半乳糖液体诱导基，于30℃摇床诱导7天。因为1.5ml Eppendorf离心管透气性不好，因此，每48小时在无菌条件下开盖一次，以保证酵母生长充足的氧气。(7)取诱导了7天的培养物，13000rpm离心1分钟，取上清。(8)诱导液用1MTris-HCl pH7.5缓冲液调pH至7.0。取诱导液30μl，加入0.5μl(0.1单位)凝血酶，混匀。1min后加入50μl(5mg/ml)纤维蛋白原，立即混匀。观察有无沉淀的产生、沉淀量多少和记录产生沉淀时间。(9)保存无沉淀产生、沉淀量少和产生沉淀时间相对长的转化子。(10)从酵母转化子扩增插入片段。取生长于葡萄糖选择培养基的对数生长晚期的酵母菌，离心去上清。用双蒸水洗涤一次，13000rpm离心15秒。沉淀悬浮于TE缓冲液。在沸水上煮3min。13000rpm离心1min。将上清储存在-20℃。取3μl用来做PCR。根据载体pYES2/CT序列设计上下游引物。<3>CCTCTATACTTTAACGTCAAGGAGAAAAAACCCCGGATCG。<4>GGCGTGAATGTAAGCGTGACATAACTAATTACATGATGCG。扩增条件为95℃5分本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于分离抗栓物质的定向进化方法，其包括如下步骤：（１）构建酵母α交配因子前导肽与部分随机肽的融合ＤＮＡ片段；（２）插入双酶切并用碱性磷酸酶处理的含有诱导型启动子的穿梭载体；（３）穿梭载体电激转化大肠杆菌，提取质粒 后电激转化酿酒酵母；（４）转接转化子至棉子糖／半乳糖液体诱导培养基，诱导培养；（５）取培养物，离心取上清，调ｐＨ至中性，加入凝血酶，混匀；１分钟后加入纤维蛋白原，混匀；取无沉淀产生、沉淀量少或产生沉淀时间相对长的活性转化子； 。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：刘秋云，何建国，李子劲，
申请(专利权)人：刘秋云，何建国，
类型：发明
国别省市：81[中国|广州]