一种半连续法生产不同分子量聚苹果酸的方法技术

本发明专利技术涉及一种半连续法生产不同分子量聚苹果酸的方法，包括以下步骤：种子液的制备；将出芽短梗霉菌的原始菌株接种在斜面培养基上培养活化；将活化后的斜面种子接种于种子培养基中，得产聚苹果酸的种子液；将种子液接种于发酵培养基中发酵；发酵结束后离心去菌体，醇沉析出聚苹果酸。本发明专利技术通过改变固有发酵模式，采用不同时间点放出发酵液，并补充相同体积发酵培养基，同时调节发酵pH，从而使各时间点所获得的聚苹果酸分子量不同，已达到获得不同分子量聚苹果酸的目的。相较于通过分批发酵，分批获得不同分子量的聚苹果酸而言，半连续发酵所需发酵时间更短，发酵稳定性更加良好。

A semi continuous method for the production of poly (malic acid) with different molecular weights

The invention relates to a production method of semi continuous different molecular weight poly malic acid method, which comprises the following steps: seed liquid preparation; the Aureobasidium pullulans strain was inoculated in the original culture medium slant activation; will be activated after slant seed was inoculated into seed medium, to produce poly apple seed liquid acid; seeds were inoculated in fermentation medium fermentation; fermentation after centrifugation to bacteria, alcohol precipitation of poly malic acid. This invention changes the natural fermentation pattern, using different time point of fermentation liquid, adding the same volume of fermentation medium, and Fermentation Regulation pH, so that each time point of the obtained poly malic acid with different molecular weight, different molecular weight has reached the goal of poly malic acid. Compared with batch fermentation, batch fermentation of poly malic acid with different molecular weights showed a shorter fermentation time and better fermentation stability.

【技术实现步骤摘要】
一种半连续法生产不同分子量聚苹果酸的方法
本专利技术属于微生物发酵
，涉及一种半连续法生产不同分子量聚苹果酸的方法。
技术介绍
高分子材料是指以高分子化合物为基础的材料，由相对分子量较高的物质构成。随着工业化发展，高分子材料无论在科学、医学还是工业上都受到广泛关注。其重要性日益显著的同时，它的不足之处也出现在人们的面前，大部分人工合成高分子材料在自然界中难以降解。在环境日益恶化的今天，人们开始关注高分子材料因不能分解而造成的环境污染问题。随着环保意识的增强，人们把材料的可降解性能的要求逐渐增加，现在对于我们正在使用或处于研发阶段的产品把是否具备可生物降解性作为重要的评价标准。为了解决上述难题，人们开始研究并制造了各种可降解材料聚苹果酸是以苹果酸为唯一单体合成的均聚高分子聚合物，特殊的立体结构使其具有生物相容性、生物可降解性和生物可吸收性等优良性质。其次，它作为一种水溶性脂肪族聚酯，具有高度水溶性、可化学衍生性。聚苹果酸的这些独特的性质，使其在医药、化妆品、环境治理以及香精香料等许多方面有着广阔的应用前景。生物法合成聚苹果酸和化学合成法相比，具有成本低、反应条件温和、分子量相对较高等优点，因此生物法合成聚苹果酸越来越吸引人们的注意。由于不同领域所需要的聚苹果酸性质不同，从而导致对聚苹果酸分子量需求的差异。聚苹果酸受到菌种及发酵条件等不同而导致聚合度的变化，从而影响力其分子量的差异。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一种半连续法生产不同分子量聚苹果酸的方法。本专利技术通过改变固有发酵模式，采用不同时间点放出发酵液，并补充相同体积发酵培养基，同时调节发酵pH，从而使各时间点所获得的聚苹果酸分子量不同，已达到获得不同分子量聚苹果酸的目的。为实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：一种半连续法生产不同分子量聚苹果酸的方法，包括以下步骤：（1）种子液的制备；将出芽短梗霉菌株活化2~3h，然后用无菌生理盐水洗下斜面菌株的孢子，制备孢子悬液，按照10%的接种量将孢子悬液转接到含有种子培养基中进行培养，培养温度25℃，摇床转速为200r/min，培养时间为40h，制得种子液；本专利技术所用菌种来源:天津北洋百川生物技术有限公司申请专利名称为一种惰性载体吸附固态发酵法生产β-聚苹果酸的方法，申请号:200910071171.2。该专利中公开了本专利技术所用菌种为出芽短梗霉(Aureobasidiumpullulans)，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种编号CGMCC.NO3337。（2）发酵罐发酵：将所得种子液以10%的量接于发酵培养基中进行发酵培养，初始转速300r/min，通风量2.5-3V·V·m，罐压在0.1MPa，温度为25-28℃；在发酵时间至90h-108h放出45%体积的发酵液，记作第一批发酵液；同时往发酵罐中补充与放料体积相同的发酵培养基后，调节PH为6.0-7.0；继续发酵98-100h后，再放出50%发酵液，该批发酵液记为第二批发酵液，同时往发酵罐中补充与放料体积相同的发酵培养基后，调节PH为6.0-7.0；继续发酵96-108h后停止发酵，终产发酵液记为第三批发酵液；（3）提取：将上述的三批发酵液分别提取后，干燥，分别得到三种分子量不同的聚苹果酸。作为优选的技术方案：优选的，所述发酵培养基组分为：蔗糖150-180g/L，蛋白胨30-35g/L，KH2PO40.08-0.1g/L，NaNO31.8-2g/L，MgSO4·7H2O0.2-0.3g/L，KCl0.3-0.5g/L，MnSO40.03-0.05g/L，余量为水。优选的，所述种子培养基组成为：蔗糖140g/L，酵母膏3g/L，硫酸铵1g/L，丁二酸2g/L，玉米浆0.1v/v，K2CO30.4g/L，MgSO4·7H2O0.1g/L，KH2PO41g/L，ZnSO4·7H2O0.05g/L，余量为水。优选的，发酵液的提纯方法为：发酵液离心除菌体后，加入4倍体积的无水甲醇，搅拌离心去除上清后，再使用蒸馏水冲洗2遍，沉淀烘干即为聚苹果酸。优选的，接种口在火焰保护下进行接种操作。有益效果本专利技术采用半连续发酵，发酵至特定时间进行放罐，并调节发酵体系pH值至菌体生长最适值或聚苹果酸合成酶系最适值，达到快速获得不同分子量聚苹果酸的效果。相较于通过分批发酵，分批获得不同分子量的聚苹果酸而言，半连续发酵所需发酵时间更短。获得相同分子量聚苹果酸的重复率较高，并且采用该模式，发酵稳定性更加良好。具体实施方式下面结合具体实施方式，进一步阐述本专利技术。应理解，这些实施例仅用于说明本专利技术而不用于限制本专利技术的范围。此外应理解，在阅读了本专利技术讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本专利技术作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。实施例1一种半连续法生产不同分子量聚苹果酸的方法，包括以下步骤：(1)种子培养将出芽短梗霉菌株进行活化2h，用无菌生理盐水洗下孢子，制得孢子悬液。按照10%的接种量接到含有100ml种子培养基的500ml挡板瓶中，培养温度25℃，摇床转速为200r/min，培养时间为40h。(2)发酵培养接种口在火焰保护下，将所得种子液以10%(v/v)的量接于装有3L发酵液的5L发酵罐中进行发酵培养；转速500r/min，通风量2.5V·V·m，罐压在0.1Mpa，温度为25℃。发酵培养基组分为：蔗糖180g/L，蛋白胨35g/L，KH2PO40.1g/L，NaNO32g/L，MgSO4·7H2O0.3g/L，KCl0.5g/L，MnSO40.05g/L，余量为水。在发酵至96h放出45%发酵液,记作“第一批”,而后向其中补充相同放料体积的发酵培养基,并调节pH至6.0。继续发酵100h再放出50%发酵液,该批发酵液记为“第二批”。其后继续补充相同发酵培养基,调节pH至6.0,发酵108h后停止发酵,终产发酵液记为“第三批”。(3)将上述的三批发酵液提取,发酵液的提纯方法为：发酵液离心除菌体后，加入4倍体积的无水甲醇，搅拌离心去除上清后，再使用蒸馏水冲洗2遍，沉淀烘干即为聚苹果酸。得出第一批发酵液中聚苹果酸重均分子量为4000-5000道尔顿。第二批发酵液中聚苹果酸重均分子量为6000-8000道尔顿。第三批发酵液中聚苹果酸重均分子量10000-12000道尔顿。实施例2(1)种子培养同实施例1。(2)发酵培养接种口在火焰保护下，将所得种子液以10%(v/v)的量接于装有3L发酵液的5L发酵罐中进行发酵培养。转速500r/min，通风量2.5V·V·m，罐压在0.1Mpa，温度为25℃。发酵培养基组分为：蔗糖180g/L，蛋白胨35g/L，KH2PO40.1g/L，NaNO32g/L，MgSO4·7H2O0.3g/L，KCl0.5g/L，MnSO40.05g/L，余量为水。在发酵至108h放出45%发酵液,记作“第一批”,而后向其中补充相同放料体积的发酵培养基,并调节pH至6.5。继续发酵98h再放出50%发酵液,该批发酵液记为“第二批”。其后继续补充相同发酵培养基,调节pH至6.5,发酵100h后停止发酵,终产发酵液记为“第三批”。(3)将上述的三批发酵液提取,发酵液的提纯方法为本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种半连续法生产不同分子量聚苹果酸的方法，其特征是，包括以下步骤：（1）种子液的制备；将出芽短梗霉菌株活化2~3h，然后用无菌生理盐水洗下斜面菌株的孢子，制备孢子悬液，按照10%的接种量将孢子悬液转接到含有种子培养基中进行培养，培养温度25℃，摇床转速为200r/min，培养时间为40h，制得种子液；（2）发酵罐发酵：将所得种子液以10%的量接于发酵培养基中进行发酵培养，初始转速300r/min，通风量2.5‑3V·V·m，罐压在0.1MPa，温度为25‑28℃；在发酵时间至90h‑108h放出45%体积的发酵液，记作第一批发酵液；同时往发酵罐中补充与放料体积相同的发酵培养基后，调节PH为6.0‑7.0；继续发酵98‑100h后，再放出50%发酵液，该批发酵液记为第二批发酵液，同时往发酵罐中补充与放料体积相同的发酵培养基后，调节PH为6.0‑7.0；继续发酵96‑108h后停止发酵，终产发酵液记为第三批发酵液；（3）提取：将上述的三批发酵液分别提取后，干燥，分别得到三种分子量不同的聚苹果酸。

【技术特征摘要】
1.一种半连续法生产不同分子量聚苹果酸的方法，其特征是，包括以下步骤：（1）种子液的制备；将出芽短梗霉菌株活化2~3h，然后用无菌生理盐水洗下斜面菌株的孢子，制备孢子悬液，按照10%的接种量将孢子悬液转接到含有种子培养基中进行培养，培养温度25℃，摇床转速为200r/min，培养时间为40h，制得种子液；（2）发酵罐发酵：将所得种子液以10%的量接于发酵培养基中进行发酵培养，初始转速300r/min，通风量2.5-3V·V·m，罐压在0.1MPa，温度为25-28℃；在发酵时间至90h-108h放出45%体积的发酵液，记作第一批发酵液；同时往发酵罐中补充与放料体积相同的发酵培养基后，调节PH为6.0-7.0；继续发酵98-100h后，再放出50%发酵液，该批发酵液记为第二批发酵液，同时往发酵罐中补充与放料体积相同的发酵培养基后，调节PH为6.0-7.0；继续发酵96-108h后停止发酵，终产发酵液记为第三批发酵液；（3）提取：将上述的三批发酵液分别提取后，干燥，分别得到三种分子量不同的聚苹果酸。2.根据权利要求1所述的...

【专利技术属性】
技术研发人员：乔长晟，赵廷彬，李雪，张卫，
申请(专利权)人：天津北洋百川生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：天津,12