一种重组乳酸乳球菌的制备方法及应用技术

本发明专利技术涉及一种重组乳酸乳球菌的制备方法及应用。其特征在于，在乳酸乳球菌细胞中胞内表达或分泌表达罗非鱼源无乳链球菌表面免疫原性蛋白(Surface immunogenic protein，Sip)，重组表达Sip蛋白所用载体分别为pNZ8124和pNZ8148，载体中插入的Sip基因片段去除了信号肽区段并添加了组氨酸序列标签，重组蛋白由乳酸链球菌素(Nisin)诱导表达，最佳诱导条件为100ng/mL Nisin诱导4h，最佳口服免疫浓度为2.24×10

Preparation and application of a recombinant Lactococcus lactis

Preparation and application of the invention relates to a recombinant Lactococcus lactis. Characterized in Lactococcus lactis cells intracellular expression or secretion expression of Streptococcus agalactiae isolated from Tilapia Surface Immunogenic Protein (Surface immunogenic protein, Sip), recombinant Sip protein expression vector used by pNZ8124 and pNZ8148 respectively, Sip base insertion vector fragment without signal peptide segments and add histidine sequence tags, recombinant protein by nisin (Nisin) induced the expression of the optimal induction conditions for 100ng/mL induced by Nisin 4h, the best oral immunization concentration is 2.24 * 10

【技术实现步骤摘要】
一种重组乳酸乳球菌的制备方法及应用
：本专利技术涉及一种罗非鱼源无乳链球菌的乳酸菌活载体口服疫苗的制备方法及应用，具体是利用乳酸乳球菌活细胞作为载体制备用于预防罗非鱼无乳链球菌(Streptococcusagalactiae，GBS)感染的口服疫苗及其应用方法。
技术介绍
：罗非鱼(Tilapia)是一种原产于非洲的热带性鱼类，隶属于鲈形目、鲈形亚目、丽鱼科(Cichlidae)、罗非鱼属(亦称丽鲷科，丽鲷属)。由于它具有生长快、食性杂、繁殖力强、无肌间刺和营养丰富等特点，受到广大养殖户和消费者的喜爱。罗非鱼在我国南方的广东、海南、广西和福建等省份广泛养殖，养殖规模和养殖密度不断加大，已成为我国目前出口量最大的淡水鱼类养殖品种。2009年以来，链球菌病在我国罗非鱼的主养区大面积暴发流行，并且发病区域逐年扩大、发病率和死亡率逐年递增。2011年我国90％的罗非鱼养殖场均出现链球菌病，死亡率为15％～90％。链球菌病已成为罗非鱼养殖业中最严重的病害，给渔民带来了巨大的损失，同时成为制约我国罗非鱼产业健康可持续发展的瓶颈。罗非鱼链球菌病主要集中于高温季节爆发流行，流行水温26℃以上，其主要症状为体色发黑、眼球突出、浑浊发白、水体中打转、体表点状或斑块出血等。无乳链球菌(Streptococcusagalactiae)和海豚链球菌(Streptococcusiniae)是罗非鱼链球菌病的主要病原，2008年之前我国罗非鱼链球菌病病原以海豚链球菌为主，之后逐渐转变为以无乳链球菌为主要致病菌。无乳链球菌又称B族链球菌(groupBstreptococcus,GBS)，为革兰氏阳性球菌，是一种广泛分布于自然界的条件致病菌，其根据荚膜多糖抗原性的差异可分为10种分子血清型(Ⅰa、Ⅰb和Ⅱ～Ⅳ)，根据其溶血性可分为α、β和γ溶血。我国流行的罗非鱼无乳链球菌的分子血清型主要为Ⅰa型，也有Ⅰb和Ⅲ型的报道，多位点序列分型结果均主要为ST-7型，噬菌体分型可以分为A、B两类，2010年之后的菌株主要为B型。无乳链球菌除了可以感染罗非鱼，还可以感染虹鳟(Oncorhynchusmykiss)、牙鲆(Paralichthysolivaceus)、大菱鲆(Psettamaxima)、真鲷(Pagrosomusmajor)和眼斑拟石首鱼(Sciaenopsocellatus)等多种咸水和淡水鱼类，目前已有12个国家报道了该病的暴发和流行，是全球流行的鱼类病害类型。罗非鱼感染无乳链球菌后会引起各内脏器官的广泛充血、水肿、变性、炎性细胞浸润和严重的细胞坏死，大量无乳链球菌侵染肝脏、脾脏、肾脏和脑等重要等内脏组织，破坏细胞结构和各种细胞器，导致各组织器官的功能障碍和衰竭，最后导致鱼体死亡。研究表明，无乳链球菌中存在荚膜多糖(capsularpolysaccharidesynthesis，Cps)、α-相关蛋白(α-likeprotein，Alp)、β蛋白质、C5α肽酶(C5apeptidase，ScpB)、层粘连蛋白结合蛋白(lamininbindingprotein，Lmb)、溶血促进因子(cohemolysin，CAMP)、FbsA蛋白、表面免疫原性蛋白(Surfaceimmunogenicprotein，Sip)和溶血素(hemolysin，Hly)等多种毒力相关因子。但不同血清型菌株中蛋白质表达存在差异，导致无乳链球菌的免疫原性和致病力不同。Sip蛋白是在2000年由Brodeur通过免疫学筛选获得并命名的，其存在所有血清的GBS菌株中，且高度保守，相似率高98％。通过不同血清型GBS的多基因组分析和筛查表明Sip蛋白可作为通用GBS疫苗候选抗原。Sip蛋白在多种模型动物中进行免疫实验，均发现其有较强的免疫原性。目前针对罗非鱼链球菌病，尚无科学有效的防治方式，主要依赖抗生素类化学药物进行防治，但实际效果并不理想，且抗生素滥用导致耐药菌株的产生以及药物残留问题也越来越严重。疫苗预防是一种公认的健康无残留、高效的病害防治手段，目前关于罗非鱼无乳链球菌疫苗的研究取得了一定的进展，包括灭活疫苗、减毒疫苗、亚单位疫苗和DNA疫苗等。但由于灭活疫苗成分相对复杂、对不同个体免疫效率差异大、对细胞内寄生细菌保护效果相对较弱，减毒疫苗毒力可能恢复和贮藏运输条件高，基因工程亚单位疫苗分离纯化工艺复杂、易被降解，DNA疫苗免疫保护效果较差，以及普遍采用注射免疫方式、工作量大，大规模免疫可操作性小等问题，目前尚无可用的商业化无乳链球菌疫苗。益生菌活载体疫苗是以益生菌为载体菌，通过基因工程技术重组病毒、细菌或寄生虫等病原基因，构建能表达外源抗原或携带外源DNA疫苗的重组益生菌，通过口服或滴鼻的途径将抗原传递至宿主黏膜系统，进而在黏膜水平刺激免疫宿主产生免疫反应。口服活载体疫苗具有生产成本低、制备简单、无需分离纯化、易于标准化、安全性好、可直接口服、无需佐剂，适合大规模群体免疫等特点，在罗非鱼链球菌疫苗的开发利用中具有广阔的应用前景。乳酸乳球菌(Lactococcuslactis)被公认为安全级(generallyrecognizedassafe,GRAS)微生物，是人和动物肠道内的常见细菌，用作活载体疫苗已经相当成熟。因此研制罗非鱼无乳链球菌的乳酸菌活载体口服疫苗能够克服已有疫苗的诸多弊端，对罗非鱼链球菌病的疫苗防控和实现罗非鱼的无抗健康养殖具有重要意义。
技术实现思路
：本专利技术目的是提供一种重组乳酸乳球菌的制备方法及应用。本专利技术所提供的重组乳酸乳球菌是由罗非鱼无乳链球菌Sip基因去除了信号肽区段，并融合了组氨酸标签序列，通过表达载体导入乳酸乳球菌NZ9000菌株得到的重组菌。本专利技术所提供的重组乳酸乳球菌中表达的重组无乳链球菌Sip蛋白的核苷酸序列和氨基酸序列如序列表1所示。本专利技术所用乳酸菌表达载体分别为pNZ8148非分泌型载体和pNZ8124分泌型载体。本专利技术所提供的重组乳酸乳球菌通过乳酸链球菌素(Nisin)诱导重组Sip蛋白表达，其最佳诱导条件为100ng/mLNisin诱导4h。本专利技术所提供的一种重组乳酸乳球菌的应用；应用于一种罗非鱼源无乳链球菌的乳酸活载体口服疫苗，其活性成分为上述的重组乳酸乳球菌，最佳诱导条件下诱导后获得。该疫苗免疫罗非鱼时，在灌胃口服剂量为100μL，隔周免疫1次，一共免疫2次的条件下，其最佳免疫浓度为2.24×1010CFU/mL。本专利技术所提供的罗非鱼无乳链球菌的乳酸菌活载体疫苗能够刺激罗非鱼产生无乳链球菌特异性抗体，并能够有效提高罗非鱼抗无乳链球菌感染的能力。附图说明图1无乳链球菌Sip基因片段的PCR产物电泳图；M代表DNAMarkerDL2000，1-4代表无乳链球菌Sip基因片段的PCR产物；图2重组表达质粒pNZ8124-Sip的双酶切产物和PCR检测产物电泳图；M代表DNAMarkerDL5000，1代表pNZ8124质粒经KpnI单酶切产物，2代表阳性克隆中扩增的Sip基因，3代表pNZ8124-Sip质粒KpnI和HindIII双酶切产物，4代表pNZ8124-Sip经KpnI单酶切产物；图3重组表达质粒pNZ8148-Sip的双酶切产物和PCR检测产物电泳图；M代表DNAMarkerDL5000，1本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种重组乳酸乳球菌的制备方法，其特征在于：所述重组乳酸乳球菌在细胞内表达或分泌表达罗非鱼无乳链球菌表面免疫原性蛋白(Surface immunogenic protein,Sip)；所述乳酸乳球菌为Lactococcus lactis NZ9000菌株；所述罗非鱼无乳链球菌Sip蛋白去除了信号肽区段并添加了组氨酸标签序列，重组Sip蛋白的核苷酸序列和氨基酸序列如序列表中的表1所示。

【技术特征摘要】
1.一种重组乳酸乳球菌的制备方法，其特征在于：所述重组乳酸乳球菌在细胞内表达或分泌表达罗非鱼无乳链球菌表面免疫原性蛋白(Surfaceimmunogenicprotein,Sip)；所述乳酸乳球菌为LactococcuslactisNZ9000菌株；所述罗非鱼无乳链球菌Sip蛋白去除了信号肽区段并添加了组氨酸标签序列，重组Sip蛋白的核苷酸序列和氨基酸序列如序列表中的表1所示。2.根据权利要求1所述一种重组乳酸乳球菌的制备方法，其特征在于：所述罗非鱼无乳链球菌Sip蛋白分别通过插入pNZ8148非分泌型载体和pNZ8124分泌型载体导入乳酸乳球菌。3.根据权利要求1所述一种重组乳酸乳球菌的制备方法，其特...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘志刚，卢迈新，蔡玉臻，可小丽，张德锋，曹建萌，
申请(专利权)人：中国水产科学研究院珠江水产研究所，
类型：发明
国别省市：广东,44