一种基于胎盘来源间充质干细胞的组织工程化软骨及其制造方法技术

本发明专利技术是一种基于胎盘来源的间充质干细胞的组织工程化软骨及其制造方法，属组织工程领域。本发明专利技术采用胎盘来源的间充质干细胞作为种子细胞，与可降解的多孔生物材料复合构建组织工程化软骨。采用该方法构建的软骨由于不受细胞来源限制，因而不需要对患者造成二次创伤，也无需经历较长的细胞培养时间，并且更容易控制质量，减小批次间或个体间效果差异，临床应用更为方便。本发明专利技术可实现关节软骨损伤的功能性修复，具有明显的临床应用前景。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及，属于组织工程领域。
技术介绍
关节软骨创伤修复目前仍是临床医学的一个巨大挑战。现有的治疗方案包括软骨组织或骨-软骨组织移植和人工关节。自体软骨是最好的移植材料，但因工体有限，而且通常需要在第二个部位手术以获取足够的用于移植的软骨组织，因此就应用而言并不理想。而人工关节替代性修复迄今为止尚难以达到功能性修复效果，并且常会伴有各种并发症的产生。尽管人们在这一领域进行了多年不懈的努力，但仍需寻找一种关节软骨损伤修复的有效治疗方法，提供适当的生理性修复，从而避免再从患者身上收集大量自体软骨组织，以一种创伤修复另外一种创伤。组织工程技术的兴起为软骨组织的生理性修复带来了希望。国内外文献相继报道有采用该技术构建软骨，在裸鼠和具有免疫力的小鼠、大鼠、兔、猪等动物体内取得成功的例子。但这些研究所采用的细胞是自体或异体软骨细胞。而软骨细胞本身来源少、取材困难、体外扩增时容易丢失表型。为克服软骨细胞作为软骨组织工程种子细胞的不足，近年来人们普遍把注意力投注到间充质干细胞一类的成体组织干细胞上，其中骨髓来源的间充质干细胞因其取材相对容易、体外扩增过程中能维持表型，保持多向分化能力而得到广泛研究，并且也在具有免疫力的大鼠、犬、羊、猪等动物模型中取得了成功，显示出骨髓间充质干细胞具有潜在的临床应用前景。然而，从骨髓中获取间充质干细胞仍然存在明显的不足。1)抽取患者骨髓需要造成手术创伤，不容易被患者接受；2)每次抽取骨髓量很少，仅5-10ml，而骨髓中间充质干细胞的含量又极低，仅为有核细胞的1/100000，因此细胞收获量极小；3)间充质干细胞虽然可以进行体外连续传代扩增，但目前大规模扩增技术尚不成熟，而且耗时费力、成本高昂，从取材到应用患者需要等待较长时间；4)由于骨髓来源的间充质干细胞具有免疫原性，因此异体之间资源无法共享。以上因素表明骨髓间充质干细胞并非软骨组织工程种子细胞的理想来源。最新研究发现，胎盘组织中具有与骨髓间充质干细胞类似的贴壁细胞。国外Jaroscak等(2000年)报道从冻存的胎盘组织中分离培养出异质性贴壁细胞。国内张毅等报道采用酶消化法从胎盘组织中获得贴壁细胞作为造血干细胞的支持细胞。因此，胎盘组织有望成为间充质干细胞的潜在的丰富的来源。目前国内外仅有零星文献涉及胎盘来源贴壁细胞的小量分离，主要用于造血支持研究，而对胎盘来源间充质干细胞的规模化分离、纯化和扩增方法则缺乏的详细的技术资料。专利技术人经过反复研究实践摸索出胎盘来源的间充质干细胞的分离方法，并证实该类细胞具有与骨髓来源间充质干细胞相似的生物学特性，可在适当的条件下分化为包括软骨细胞在内的多种细胞类型。由于胎盘组织为废弃组织，来源丰富、细胞收获量大，因此胎盘来源的间充质干细胞有望成为软骨组织工程理想的种子细胞。
技术实现思路
本专利技术的目的是为克服上述软骨组织工程研究中的不足，提供一种以胎盘来源的间充质干细胞为种子细胞的组织工程化软骨及其制造方法。其方法如下1)胎盘来源间充质干细胞的分离、培养和扩增a.对新鲜娩出胎盘立即进行放血、灌注，以去除血细胞和组织碎片；b.持续灌注，或将胎盘小叶剪碎，用胶原酶消化，收集细胞成分；c.采用免疫磁珠吸附法或Percoll密度梯度离心法收集单个核细胞；d.测定细胞倍增时间和生长曲线；e.对获得的细胞进行冷冻保存；e.采用生物反应器对所获得的细胞，包括低温保存后复苏的细胞进行规模化扩增。2)组织工程化软骨的构建a.支架材料预处理支架材料可以是可降解多孔生物陶瓷材料，如α-或β-磷酸三钙；也可以是胶原、聚合物类。本专利技术中优选β-磷酸三钙多孔生物陶瓷。材料预制成各种规格的圆片状，或根据需要预制成特定形状，60gray60Co照射，也可以是75％酒精浸泡10分钟～1小时消毒。用前用95％酒精浸泡以提高亲水性，然后用无血清培养基或PBS缓冲液将酒精置换出来，灭菌干纱布吸干液体。已经灭菌的胶原材料可以直接应用。b.组织工程化软骨的构建将新鲜分离或经过扩增、或经过冷冻保存的胎盘来源间充质干细胞制成1～2×107/ml的细胞悬液，轻轻滴加在支架材料上，并轻轻翻转材料，使细胞分布尽量均匀。将细胞-多孔支架材料复合体放入孵箱中，37℃，5％CO2，饱和湿度下静置6～10小时，使细胞贴附在材料的孔洞内和表面。然后转移入旋转式生物反应器内进行三维立体培养。旋转速度15~50rpm。c.组织工程化软骨的保存构建好的组织工程化软骨可以采用低温冷冻保存技术进行储存和运输。冷冻保存方法可以是以二甲基亚砜(DMSO)为冷冻保护剂的常规保存技术，也可以是以VS55为保护剂的玻璃化无冰晶保存技术。有益效果本专利技术组织工程化软骨是以胎盘来源的间充质干细胞作为种子细胞，细胞取自废弃的胎盘组织，来源丰富、收获量大、无免疫排斥反应。由于该细胞可以冷冻保存，并在人群之间共享，因此可以实现随用随取，无需等待，从而方便临床应用。另一方面，使用的可降解多孔生物陶瓷支架材料生物相容性好，机械强度高，微结构合理，适于软骨细胞的长入和细胞外基质沉积，其降解速率可以也软骨组织的新生速度相协调，最终在体内形成正常的有功能的软骨组织，实现功能性软骨的再生，再生的软骨组织可以与周围组织自然整合，且具有更大的最终强度和稳定性，对损伤或缺损实现生理性修复。由于可降解多孔生物陶瓷加工工艺成熟，可批量生产，胎盘来源的间充质干细胞取材容易、不会有免疫排斥，因此本专利技术制造的组织工程化软骨具有广阔的临床应用前景。具体实施例方式实施例1人胎盘来源间充质干细胞的获得胎盘娩出后立即置于无菌托盘或容器中，经脐动脉注入含有抗凝剂和抗生素的平衡盐溶液，放血，并开始灌注。抗凝剂可以是1~100u/mL的肝素，抗生素可以是青链霉素。收集灌注液，离心获得细胞成分；或初步灌注后无菌剪取胎盘小叶，用胰蛋白酶或胶原酶消化胎盘组织，获得细胞悬液，再将细胞悬液过细胞筛，除去组织碎片和血细胞，获得的细胞重新悬浮，用密度为1.073g/mL的percoll，以500g离心力离心30分钟，收获界面细胞层，PBS洗涤后接种培养瓶或培养板，或直接用于其它目的。也可以用D7-FIB或NGFR标记的免疫磁珠来分离带有某种特殊标记的间充质干细胞。采用流式细胞仪检测胎盘来源间充质干细胞的表型，如CD29、CD34、CD44、CD45、CD105、CD166、HLA-DR等。同时检测细胞周期，确定处于G0-G1期细胞的比例。实施例2一种基于胎盘来源的间充质干细胞的组织工程化软骨的制造方法将新鲜分离或冻存复苏的人胎盘来源间充质干细胞制备成1.5～2×107/ml的细胞悬液，接种到圆柱状β-TCP支架上，尽量使细胞分布均匀。β-TCP多孔生物陶瓷材料可以由上海贝奥路公司专利的方法和工艺生产，材料经60gray60Co照射消毒后用于组织工程化关节软骨构建，在一个优选的方案中，其微结构为孔径-100～300μm，孔隙率-52％，孔间连接径-30～100μm。静置6小时后，将复合物移入RCCS(旋转式生物反应器，Synthecom公司)，在含10％FCS的DMEM中培养48小时，转速为30rpm。培养后的复合物可以直接用于临床修复患者关节软骨缺损，也可低温保存，作为组织工程化软骨组织库。权利要求1.一种基于胎盘来源的间充质干细胞的本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种基于胎盘来源的间充质干细胞的组织工程化软骨及其制造方法。以从胎盘组织中分离提取获得的间充质干细胞作为种子细胞，与可降解多孔生物支架材料复合构建组织工程化软骨。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：郭希民，王常勇，周晓东，段翠密，江红，董灵芝，李晶，
申请(专利权)人：中国人民解放军军事医学科学院基础医学研究所，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]