“具抗血栓作用的日本七鳃鳗口腔腺ＫＧＤ模体蛋白的基因克隆与表达”属于生物技术领域，涉及到日本七鳃鳗口腔腺中一条具ＫＧＤ模体蛋白的ｃＤＮＡ序列及克隆、与之对应的蛋白质序列及其在大肠杆菌或毕赤酵母中的表达，及其与血小板细胞膜上糖蛋白ｇｐⅡｂ／Ⅲａ结合而竞争性拮抗纤维蛋白原与血小板的结合，从而抑制血小板聚集的最终共同通路，阻断血栓形成的生物学活性。其具有抗血栓药物开发价值。
【技术实现步骤摘要】
具抗血栓作用的日本七鳃鳗口腔腺KGD模体蛋白的基因克隆与表达属于生物
，涉及到日本七鳃鳗口腔腺中一条具KGD模体蛋白的cDNA序列及克隆、与之对应的蛋白质序列及其在大肠杆菌或毕赤酵母中的表达，及其与血小板细胞膜上糖蛋白gpIIb/IIIa专一性结合而竞争性拮抗纤维蛋白原与血小板的结合，防止了血小板的活化和GPIIb/IIIa受体构象的改变，阻断受体与多种配体的结合，从而抑制血小板聚集的最终共同通路，阻断血栓形成的生物学活性。
技术介绍
称为“抗血小板药物”的一类药物已经被作为治疗血栓性疾病的有效手段在临床上得到广泛应用。正常情况下，体内止血、凝血系统与纤溶系统处于生理性平衡，保持正常血流状态。但在一些病理情况下，如血管内膜损伤或静脉血流阻滞时，由于血小板活化并粘附到内皮下组织，进而引发一系列止血、凝血过程，最后形成了血栓。血小板在血栓形成，特别是动脉血栓形成过程中起着重要作用。当血管内皮损害暴露内皮下组分时，血小板就会被活化，发生血小板的粘附和聚集。血栓的主要成分是由活化的血小板和纤维蛋白组成。因此，特异的抗活化血小板和抗纤维蛋白的药品可以作为血栓导向剂。目前所研制的抗血小板抗体主要是针对活化血小板上两个主要位点而制备的①GPIIb/IIIa②GMP140。而最有效的抗血小板药物就是GPIIb-IIIa拮抗剂，因为不管通过什么受体，什么代谢途径，最后必须通过GPIIb-IIIa复合物的纤维蛋白原受体，血小板才能发生“聚集”而形成血栓(Huang TF et al.，1987)(Shebuski RJ et al.，1989)。KGD(1-2)序列能特异性与血小板细胞膜上糖蛋白GPIIb/IIIa特异性结合而竞争性拮抗纤维蛋白原与血小板的结合，防止了血小板的活化和GPIIb/IIIa受体构象的改变，阻断受体与多种配体的结合，从而抑制血小板聚集的最终共同通路，阻断血栓的形成。由于KGD模体蛋白为血小板糖蛋白GPIIb/IIIa抑制剂，其凭借所具有的KGD模体专一与血小板糖蛋白GPIIb/IIIa结合而与血管内皮细胞表面表达的整合素αVβ3的结合能力却极低或没有，这个特性将使KGD模体蛋白具有强效抗凝功能，而却无溶血等副作用。由此可见，KGD序列多肽将成为GPIIb/IIIa拮抗剂中的主力军，具有抗血栓药物开发的重要价值。目前在自然界只在毒蛇中发现了两种具KGD模体的天然蛋白美国响尾蛇蛇毒barbourin(1)和乌苏里蝮蛇毒Ussurista(2)，而本项目的日本七鳃鳗口腔腺KGD模体蛋白Lampetrin4的cDNA序列及其蛋白序列及功能在国内外尚无人研究和报道，本专利技术在世界上尚属首次发现。参考文献1.Scarborough RM，Rose JW，Hsu MA，Phillips DR，Fried VA，Campbell AM，Nannizzi L，et al.Barbourin，a GPIIb-IIIa-specificintegrin antagonist from the venom of sistrurus m.barbouri.J Biol Chem，1991，266(15)9359-93622.Oshikawa K and Terada S.Ussuristatin2，a novel KGD-bearing disintegrin from Agkistrodon ussuriensis venom.J Biol Chem，1999，125.
技术实现思路
日本七鳃鳗(Lampetra japonica)属圆口纲(Cyclostomata)、七鳃鳗目、七鳃鳗科、七鳃鳗属，是迄今发现的最古老的无颌脊椎动物。其为海洋洄游性鱼类，成体生活在海洋，经常用吸盘附在其它鱼体上吸食其血与肉，使被吸附的鱼血流不止。日本七鳃鳗的这种独特生活习性暗示着其口腔腺中必定具有强效抗凝物质。本专利技术在于从日本七鳃鳗口腔腺cDNA文库中发现了一条能翻译出KGD(Lys-Gly-Asp)模体的开放阅读框，经对其mRNA全长的进行钓取、测序、生物信息学分析后发现，这条基因为在自然界首次发现，为来源于日本七鳃鳗的KGD多肽新基因。经对其进行cDNA克隆后，对其重组蛋白在大肠杆菌中进行了高效诱导表达。此KGD重组蛋白的生物学活性涉及到抗血小板聚集进而抗血栓形成之功能。本专利技术涉及日本七鳃鳗口腔腺中一条具KGD模体蛋白的cDNA序列及克隆、与之对应的蛋白质序列及其在大肠杆菌或毕赤酵母中的表达，及其抑制血小板聚集的最终共同通路从而阻断血栓形成的生物学活性。本专利技术从日本七鳃鳗口腔腺中分离提取mRNA，利用从前期构建的cDNA文库、EST文库中获得的生物学信息及mRNA全长钓取的测序结果选取开放阅读框设计引物，采用RT-PCR方法获得了一条KGD蛋白的cDNA及其序列，本专利技术还提供了其在人肠杆菌BL21中成功表达的蛋白及其序列，此KGD模体重组蛋白具抗血小板聚集的作用，可作为抗血栓药物进一步开发。KGD模体蛋白Lampetrin4的cDNA序列381bp长，其蛋白质由127个氨基酸组成，含一个KGD模体，蛋白分子量为12,954Da。其GDNA序列及由其推导的蛋白质氨基酸序列为1 atggcctccaggctgcttctacgagcgtctctcaacgccggccgtM A S R L L L R A S L N A G R46 cgtgtcgcggccgtcgggagcgtgagaccggcgatgcgagccatgR V A A V G S V R P A M R A M91 gcgagcggaggtggcatccccactgatgaagaacaggccacgggcA S G G G I P T D E E Q A T G136 ttggagaggttgaccatggaggctaagaaaaaaggcactgaccccL E R L T M E A K K K G T D P181 tggagcattgagccacccaagacttacgcaggaaccaaggaagatW S I E P P K T Y A G T K E D226 ccacacattgtgccgtccattggtgaaaagcggctgatcggctgcP H I V P S I G E K R L I G C271 atctgtgaggaggacaacacagctgtggtgtggttctggctgcacI C E E D N T A V V W F W L H316 aagggtgactgccagcgctgcccttcttgtggtgcctcctacaagK G DC Q R C P S C G A S Y K361 ctcgttccccacgagctgccgcactga 387L V P H E L P H *于大肠杆菌中表达的重组KGD模体蛋白Lampetrin4具有抑制由ADP诱导的人血小本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种来源于日本七鳃鳗口腔腺的ＫＧＤ（Ｌｙｓ－Ｇｌｙ－Ａｓｐ）模体蛋白的ｃＤＮＡ序列及由其推导的蛋白质氨基酸序列，其特征在于ｃＤＮＡ序列３８１ｂｐ长，其蛋白质由１２７个氨基酸组成，含一个ＫＧＤ（Ｌｙｓ－Ｇｌｙ－Ａｓｐ）模体，蛋白分子量为１２，９５４Ｄａ。此ＫＧＤ模体蛋白被命名为Ｌａｍｐｅｔｒｉｎ４，其ｃＤＮＡ序列及由其推导的蛋白质氨基酸序列为： １ ａｔｇｇｃｃｔｃｃａｇｇｃｔｇｃｔｔｃｔａｃｇａｇｃｇｔｃｔｃｔｃａａｃｇｃｃｇｇｃｃｇｔ Ｍ Ａ Ｓ Ｒ Ｌ Ｌ Ｌ Ｒ Ａ Ｓ Ｌ Ｎ Ａ Ｇ Ｒ ４６ ｃｇｔｇｔｃｇｃｇｇｃｃｇｔｃｇｇｇａｇｃｇｔｇａｇａｃｃｇｇｃｇａｔｇｃｇａｇｃｃａｔｇ Ｒ Ｖ Ａ Ａ Ｖ Ｇ Ｓ Ｖ Ｒ Ｐ Ａ Ｍ Ｒ Ａ Ｍ ９１ ｇｃｇａｇｃｇｇａｇｇｔｇｇｃａｔｃｃｃｃａｃｔｇａｔｇａａｇａａｃａｇｇｃｃａｃｇｇｇｃ Ａ Ｓ Ｇ Ｇ Ｇ Ｉ Ｐ Ｔ Ｄ Ｅ Ｅ Ｑ Ａ Ｔ Ｇ １３６ ｔｔｇｇａｇａｇｇｔｔｇａｃｃａｔｇｇａｇｇｃｔａａｇａａａａａａｇｇｃａｃｔｇａｃｃｃｃ Ｌ Ｅ Ｒ Ｌ Ｔ Ｍ Ｅ Ａ Ｋ Ｋ Ｋ Ｇ Ｔ Ｄ Ｐ １８１ ｔｇｇａｇｃａｔｔｇａｇｃｃａｃｃｃａａｇａｃｔｔａｃｇｃａｇｇａａｃｃａａｇｇａａｇａｔ Ｗ Ｓ Ｉ Ｅ Ｐ Ｐ Ｋ Ｔ Ｙ Ａ Ｇ Ｔ Ｋ Ｅ Ｄ ２２６ ｃｃａｃａｃａｔｔｇｔｇｃｃｇｔｃｃａｔｔｇｇｔｇａａａａｇｃｇｇｃｔｇａｔｃｇｇｃｔｇｃ Ｐ Ｈ Ｉ Ｖ Ｐ Ｓ Ｉ Ｇ Ｅ Ｋ Ｒ Ｌ Ｉ Ｇ Ｃ ２７１ ａｔｃｔｇｔｇａｇｇａｇｇａｃａａｃａｃａｇｃｔｇｔｇｇｔｇｔｇｇｔｔｃｔｇｇｃｔｇｃａｃ Ｉ Ｃ Ｅ Ｅ Ｄ Ｎ Ｔ Ａ Ｖ Ｖ Ｗ Ｆ Ｗ Ｌ Ｈ ３１６ ａａｇｇｇｔｇａｃｔｇｃｃａｇｃｇｃｔｇｃｃｃｔｔｃｔｔｇｔｇｇｔｇｃｃｔｃｃｔａｃａａｇ Ｋ Ｇ Ｄ Ｃ Ｑ Ｒ Ｃ Ｐ Ｓ Ｃ Ｇ Ａ Ｓ Ｙ Ｋ ３６１ ｃｔｃｇｔｔｃｃｃｃａｃｇａｇｃｔｇｃｃｇｃａｃｔｇａ ３８７...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：李庆伟，王继红，吴毓，韩晓曦，
申请(专利权)人：辽宁师范大学，
类型：发明
国别省市：91[中国|大连]
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