感受态细胞快速转化方法技术

本发明专利技术涉及一种感受态细胞快速转化（ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ）之方法，其包含下列步骤：ａ．将质粒ＤＮＡ与感受态细胞混合，形成混合物；ｂ．将该混合物涂于温热之选择培养基上；及ｃ．在培养基上培养该混合物。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种基因转化之方法，特别涉及一种感受态细胞快速转化(transformation)之方法。
技术介绍
大肠杆菌为现代分子生物技术中应用最广之微生物，尤其在分子生物学研究及遗传工程领域皆为不可或缺之宿主细胞，几乎所有生物技术相关之实验室均会利用各种大肠杆菌之遗传突变株作为宿主细胞进行DNA或蛋白质分子之大量复制。将外来之DNA分子导入大肠杆菌宿主细胞之技术就是所谓之“转化”；而经初步处理使其易于吸收外来DNA分子之宿主细胞称之为“感受态细胞(competent cell)”。由此可知制备感受态细胞及将感受态细胞转化之技术在近代遗传工程上之重要性，此技术之专利技术可溯自1970年Mandel，M.和Higa A.(J.Mol.Biol.53159-162)发表之CaCl2化学转化方法，经过了近30年之改进，其转化方法之操作时间仍需1.5～3.0小时，主要原因为化学处理之过程对细胞造成一些伤害，需要一个加入培养基之恢复步骤，让转化过程受到伤害之细胞有足够之时间及养分恢复生理机能以产生抗药能力，才可进行涂菌筛选之步骤，否则转化效率将下降数倍。近年有一种快速转化技术称为电穿孔转化法(electroporation)，虽然可利用瞬间电流将DNA分子导入大肠杆菌宿主细胞，但电穿孔处理之细胞仍须加入培养基进行约1小时之恢复步骤才可获得较高之转化效率(Dower et.al.，1988 Nucleic Acids Res.166127-6145)。1988年Golub E.I.(Nucleic Acids Res.161641)发表1分钟之转化方法，虽然舍去加入培养基之恢复步骤，但其效率只能达到104～105转化菌落数/μg质粒DNA。最近几年益生生技开发股份有限公司研发出一种快速转化技术(中国台湾专利公告号I229696)，可舍去传统上让转化后之大肠杆菌细胞恢复之冗长步骤，且不会降低原来之转化效率。该实施方式为将质粒DNA及大肠杆菌细胞在管中混合、热休克处理，然后将转化后之细胞以较低温度之涂菌工具直接涂布在较低温度之选择培养基上，不须加入非选择性培养基(SOC、LB...)进行恢复之步骤，因而将传统上耗1.5～3.0小时、多步骤之转化程序缩短为几分钟、单管可完成，而又不降低原来之转化效率。然而此种方法虽已改良前有的各种转化方法，但使用时仍须辅以热休克处理用的控温装置，且细胞置于管内加热，可能会受热不匀。因此若能发展出一种舍去让转化后之细胞恢复之冗长步骤、不须使用热休克处理之控温装置、细胞不会受热不匀，而且不会降低原来转化效率的转化方法，将可大大节省进行转化方法时所需之人力、时间及金钱。
技术实现思路
本专利技术之目的为提供一种感受态细胞快速转化之方法，其主要特点在于简化热休克处理之步骤、改善细胞受热不均之情形并舍去让转化后之大肠杆菌细胞恢复之冗长步骤，而且不会降低原来转化效率。转化细胞可从多种微生物制得，而大部分由大肠杆菌之不同菌种制得，例如HB101、DH5α、GM2929、XL1-Blue、TG1、BL21及JM109等。大肠杆菌为现代分子生物技术中应用最广之微生物，尤其在分子生物学研究及遗传工程领域皆为不可或缺之宿主细胞，几乎所有生物技术相关之实验室均会利用各种大肠杆菌之遗传突变株作为宿主细胞进行DNA或蛋白质分子之大量复制。将外来之DNA分子导入大肠杆菌宿主细胞之技术就是所谓之“转化”；而经初步处理使其易于吸收外来DNA分子之宿主细胞称之为“感受态细胞(competent cell)”。依中国台湾专利公告号I229696之大肠杆菌快速转化方法，是将质粒DNA与大肠杆菌感受态细胞混合，将此混合物以热休克处理，再以低温涂菌工具，将上述混合物涂布于低温选择培养基上，进而进行转化子之选择培养。本专利技术除了承续上述方法的优点，尤其是可省略让转化后之细胞恢复之冗长步骤外，更进一步简化了热休克处理的步骤，也就是将质粒DNA与感受态细胞之混合物直接涂布于温度较高的选择培养基上，通过选择培养基的温度直接对细胞进行热休克处理。本专利技术提供一种感受态细胞快速转化之方法，其包含下列步骤a.将质粒DNA与感受态细胞混合，形成混合物；b.将该混合物涂布于温热之选择培养基上；及c.在培养基上培养该混合物。本专利技术一般可获得大于106转化效率，较佳为大于107以上转化效率，最佳为大于108以上转化效率。本专利技术可省略添加培养液之恢复步骤。即不须在涂布于温热之选择培养基前另添加非选择性培养基培养几十分钟。本专利技术可省略热休克处理步骤。即不须在涂布于温热之选择培养基前进行热休克处理。温热之选择培养基的温度为20℃～50℃，较佳为30℃～44℃，最佳为34℃～40℃。以涂布于温热之选择培养基之步骤，代替传统以预热好的控温装置进行热休克处理，优点有三(一)省去传统热休克处理的时间，速度更快；(二)不须另外花时间准备预热好的控温装置，实验准备工作更省时省力；(三)细胞被涂布在温度较高的选择培养基上均匀受热，而不是被装在管中从管壁外间接受热，因此接触面积较广且受热较均匀。根据本专利技术，在质粒DNA与感受态细胞混合完毕、涂布于温热之选择培养基之前，可还包含一个或多个选自下列步骤将质粒DNA与感受态细胞之混合物置于冰浴处理；及/或将质粒DNA与感受态细胞之混合物以热休克处理。根据本专利技术，热休克处理之温度为20℃～50℃，较佳为34℃～45℃。根据本专利技术，在涂布于温热之选择培养基之后、在培养基上培养该混合物之前，亦可选择性的加入一冷却处理步骤，即将涂布转化细胞后的温热之选择培养基置于冷却环境中降温。该冷却环境为室温、冰浴、冷藏装置、冷冻装置或任何温度低于该温热选择培养基之环境。冷却环境之温度为-35℃～30℃，较佳为-20℃～20℃，更佳为-10℃～10℃。本专利技术方法中与转化细胞混合之质粒DNA可为一般质粒DNA或重组质粒DNA，较佳为重组质粒DNA。本专利技术中所使用之选择培养基为含抗生素之培养基。大肠杆菌在分类上属革兰氏阴性菌(gram negative)。目前大部分之革兰氏阴性菌或阳性(gram positive)菌之感受态细胞制备及转化技术乃改良自大肠杆菌之相关技术(Method In Enzymology 20463-113)，故本专利技术之转化方法可应用于大部分之细菌类(革兰氏阴性菌或阳性菌)之转化技术。在最佳情况下，本专利技术之感受态细胞由大肠杆菌制备。由于本专利技术方法简化以往转化冗长程序，故本专利技术非常适合进行自动化过程。所以，本专利技术还提供一种感受态细胞快速转化之装置，其包含a.混合质粒DNA与感受态细胞之元件；b.涂布来自步骤a混合物于温热选择培养基上之元件；及c.在培养基上培养该混合物之元件。本专利技术之装置可还包含热休克处理之元件。本专利技术之装置亦可还包含冷却处理之组件。本专利技术感受态细胞快速转化之装置中各元件并未涉及复杂机械装置，可以一般市售商品制造本专利技术之装置。以下实施例属非局限性并仅作为在本专利技术中各种可能及具有特色之代表。具体实施例方式实施例1以温选择培养基代替传统热休克处理步骤本实施例中，以益生生技开发公司之ECOS-101感受态细胞(相当于DH5α之菌种，以类似Hanahan D.，1983，J.Mol.Bio.166557-580所述方法制备)本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种感受态细胞快速转化之方法，其特征是包含下列步骤：ａ．将质粒ＤＮＡ与感受态细胞混合，形成混合物；ｂ．将该混合物涂布于温热之选择培养基上；及ｃ．在培养基上培养该混合物。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：陈子智，
申请(专利权)人：益生生技开发股份有限公司，
类型：发明
国别省市：71[中国|台湾]