作为治疗剂的修饰肽制造技术

本发明专利技术涉及Ｆｃ区与生物活性肽的融合体和采用生物活性肽制备药物的方法。在本发明专利技术中，通过包括以下步骤的方法制备药理学活性化合物：ａ）选择至少一种调节目的蛋白活性的肽；和ｂ）制备一种药理学因子，其包含共价连接于所述选定肽的至少一个氨基酸的至少一个Ｆｃ区。与载体的连接增加所述肽的半寿期，所述肽在其它情况下可能在体内快速降解。优选的载体是Ｆｃ区。所述肽最好通过噬菌体展示、大肠杆菌展示、核糖体展示、ＲＮＡ－肽筛选或化学－肽筛选进行选择。（*该技术在2019年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
本申请是申请日为1999年10月25日，申请号为99814727.3，专利技术名称为“作为治疗剂的修饰肽”的专利技术专利申请的分案申请。
技术介绍
重组蛋白是一类新兴的治疗剂。这种重组治疗剂已经引起蛋白生成和化学修饰的进步。这种修饰可以保护治疗蛋白，主要通过阻断它们暴露于蛋白水解酶。蛋白修饰也可以提高治疗蛋白的稳定性、循环时间和生物活性。描述蛋白修饰和融合蛋白的综述文章是Francis(1992)，Focus on Growth Factors34-10(Mediscript，London)，其通过引用结合到本文中。一种有用的修饰是与抗体的“Fc”区结合。抗体包括两个功能独立的部分一个结合抗体的称为“Fab”的可变区和一个称为“Fc”的恒定区，恒定区与诸如补体激活和由吞噬细胞攻击的效应子功能有关。Fc的血清半寿期长，而Fab是短寿的。Capon等(1989)，Nature337525-31。当Fc区与治疗蛋白一起构建时，Fc区可以提供较长的半寿期，或加入一些功能，诸如Fc受体结合、A蛋白结合、补体固定，也许甚至加入胎盘转运(出处同前)。表1总结了本领域已知的Fc融合体的应用。表1-Fc与治疗蛋白的融合体 研制治疗剂的一种相当不同的方法是肽文库筛选。蛋白配体与其受体的相互作用通常发生在相对大的界面上。然而，正如用人生长激素及其受体所证明的，界面上仅少数关键残基提供大部分结合能。Clackson等(1995)，Science267383-6。大多数蛋白配体仅在适当的拓扑结构下展示结合表位，或用于与结合无关的功能。因此，仅“肽”长度(2-40个氨基酸)的分子可以结合于特定大蛋白配体的受体蛋白。这种肽可以模拟所述大蛋白配体的生物活性(“肽激动剂”)，或通过竞争结合抑制所述大蛋白配体的生物活性(“肽拮抗剂”)。噬菌体展示肽文库已经作为鉴定这种肽激动剂和肽拮抗剂的有力的方法出现。参见例如Scott等(1990)，Science249386；Devlin等(1990)，Science249404；1993年6月29日授予的美国专利第5,223,409号；1998年3月31日授予的美国专利第5,733,731号；1996年3月12日授予的美国专利第5,498,530号；1995年7月11日授予的美国专利第5,432,018号；1994年8月16日授予的美国专利第5,338,665号；1999年7月13日授予的美国专利5,922,545号；1996年12月19日公开的WO96/40987；和1998年4月16日公开的WO98/15833(每个文献均通过引用结合到本文中)。在这种文库中，通过与丝状噬菌体的外被蛋白融合呈现随机肽序列。通常，对抗体固定的受体胞外域亲和洗脱所述呈现的肽。可以通过连续数轮亲和纯化和再繁殖富集保留的噬菌体。可以对最佳结合肽测序，以鉴定一个或多个结构相关肽家族内的关键残基。参见例如Cwirla等(1997)，Science2761696-9，其中鉴定了两个不同的家族。所述肽序列也可以提示哪些残基可以通过丙氨酸扫描或通过在DNA水平上诱变来置换。可以创造诱变文库并对其筛选，以进一步优化最佳结合物的序列。Lowman(1997)，Ann.Rev.Biophys.Biomol.Struct.26401-24。蛋白-蛋白相互作用的结构分析也可以用来提示模拟大蛋白配体结合活性的肽。在这种分析中，晶体结构可以提示所述大蛋白配体关键残基的身份和相对方向，据此可以设计肽。参见例如Takasaki等(1997)，Nature Biotech.151266-70。这些分析方法也可以用来研究受体蛋白和通过噬菌体展示选择的肽之间的相互作用，这可以提示对所述肽的进一步修饰以增加结合亲和性。其它方法在肽研究方面与噬菌体展示竞争。可以将肽文库与lac阻抑物羧基端融合并在大肠杆菌中表达。另一基于大肠杆菌的方法允许通过与肽聚糖结合的脂蛋白(PAL)融合而呈现在细胞外膜上。在下文中，这些方法和相关方法被统称为“大肠杆菌展示”。在另一方法中，在核糖体释放之前停止随机RNA的翻译，产生仍附着有其结合的RNA的多肽文库。在下文，该方法和相关方法被统称为“核糖体展示”。其它方法利用肽与RNA的化学键；参见例如Robert和Szostak(1997)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，9412297-303。在下文，该方法和相关方法统称为“RNA-肽筛选”。已经开发了化学衍生的肽文库，其中肽固定在稳定的非生物材料上，诸如聚乙烯棒或溶剂可渗透的树脂。另一化学衍生肽文库使用光刻法来筛选固定到玻璃玻片上的肽。在下文，这些方法和相关方法称为“化学肽筛选”。化学肽筛选可能是有利的，因为它允许利用D-氨基酸和其它非天然类似物以及非肽组分。在Wells和Lowman(1992)，Curr.Opin.Biotechnol.3355-62中综述了生物方法和化学方法。在概念上，采用噬菌体展示和上述的其它方法，人们可以发现任何蛋白的肽模拟物。这些方法已经用于表位作图、鉴定蛋白-蛋白相互作用中关键的残基，并且用作发现新治疗剂的指导。例如Cortese等(1996)，Curr.Opin.Biotech.7616-21。现在肽文库最常用于免疫学研究，例如表位作图。Kreeger(1996)，The Scientist10(13)19-20。本文特别关注的是肽文库和其它技术在发现药理学活性肽方面的应用。在表2中总结了本领域鉴定的许多这种肽。在所列出的出版物中描述了所述肽，每个出版物通过引用结合到本文中。描述了所述肽的药理学活性，并且在许多情况下在括号内后接其简写术语。这些肽中的某些肽已经进行了修饰(例如形成C末端交联二聚体)。通常，根据与药理学活性蛋白受体(例如EPO受体)的结合筛选肽文库。在至少一种情况下(CTLA4)，根据与单克隆抗体的结合筛选所述肽文库。表2-药理学活性肽a在该栏中所列出的蛋白可以被相关的肽(例如EPO受体，IL-l受体)结合或被相关的肽模拟。所列出的参考文献分别用来说明该分子是被所述肽结合还是被所述肽模拟。bFST是由本专利技术分子模拟的一种胸腺激素，而不是由本专利技术分子结合受体。通过肽文库筛选鉴定的肽已经被认为是研制治疗剂的指导，而不是被认为是治疗剂本身。同其它蛋白和肽一样，它们将在体内通过肾过滤、网状内皮系统中的细胞清除机制或蛋白水解降解而被快速去除。Francis(1992)，Focus on Growth Factors34-11。结果，本领域目前应用所鉴定的肽来确证药物靶或作为设计尚不能通过化学文库筛选容易或快速鉴定的有机化合物的脚手架。Lowman(1997)，Ann.Rev.Biophys.Biomol.Struct.26401-24；Kay等(1998)，Drug Disc.Today3370-8。本领域将从一种方法中获益，通过该方法这种肽可以更容易产生治疗剂。专利技术概述本专利技术涉及一种方法，采用该方法，通过与载体融合增加一种或多种生物活性肽的体内半寿期。在本专利技术中，药理学活性化合物的制备方法包括a)选择调节目的蛋白活性的至少一种肽；和b)制备一种药物，其包含至少一种共价连接于至少一种选定肽的氨基酸序列的载体。优选的载体是Fc区本文档来自技高网...

【技术保护点】
下式物质及其多聚体的组合物：（Ｘ↑［１］）↓［ａ］－Ｆ↑［１］－（Ｘ↑［２］）↓［ｂ］其中：Ｆ↑［１］是Ｆｃ区；Ｘ↑［１］和Ｘ↑［２］分别独立地选自－（Ｌ↑［１］）↓［ｃ］－Ｐ↑［１］、－（Ｌ↑［１］）↓［ｃ ］－Ｐ↑［１］－（Ｌ↑［２］）↓［ｄ］－Ｐ↑［２］、－（Ｌ↑［１］）↓［ｃ］－Ｐ↑［１］－（Ｌ↑［２］）↓［ｄ］－Ｐ↑［２］－（Ｌ↑［３］）↓［ｅ］－Ｐ↑［３］和－（Ｌ↑［１］）↓［ｃ］－Ｐ↑［１］－（Ｌ↑［２］）↓［ｄ］－Ｐ↑［２］－（Ｌ↑［３］）↓［ｅ］－Ｐ↑［３］－（Ｌ↑［４］）↓［ｆ］－Ｐ↑［４］，Ｐ↑［１］、Ｐ↑［２］、Ｐ↑［３］和Ｐ↑［４］分别独立地为随机化的ＡＧＰ－３结合肽的序列；Ｌ↑［１］、Ｌ↑［２］、Ｌ↑［３］和Ｌ↑［４］分别独立地为接头；而 ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ和ｆ分别独立地为０或１，前提是ａ和ｂ中至少一个为１，其中肽指的是２至４０个氨基酸的分子，并且Ｘ↑［１］或Ｘ↑［２］都不是天然蛋白。

【技术特征摘要】
...

【专利技术属性】
技术研发人员：U菲格，CF刘，J彻塔姆，TC波尼，
申请(专利权)人：安姆根有限公司，
类型：发明
国别省市：US[美国]