红细胞生成素／免疫球蛋白Ｆｃ融合蛋白，ＥＰＯ／Ｆｃ融合蛋白基因结构，起码包括人ＣＤ５ｌｅａｄｉｎｇ基因序列，还包括ＥＰＯ／Ｆｃ基因，ＥＰＯ／Ｆｃ基因包括１６５个ＥＰＯ成熟分泌蛋白的氨基酸基因序列，以及２３２个人免疫球蛋白ＩｇＧ２Ｆｃ或ＩｇＧ１Ｆｃ段氨基酸的基因序列，ＥＰＯ／Ｆｃ融合蛋白为双体，由Ｆｃ的连接部Ｈｉｎｇｅ的双硫键将两个单链ＥＰＯ／Ｆｃ相结合。本发明专利技术创造出一种新型的ＥＰＯ／Ｆｃ融合蛋白，并在哺乳动物细胞中得到表达。保持或加强红细胞生成素的全部生物活性，同时延长其在体内的循环半衰期，而且具有简化的生产提纯的工序，本发明专利技术的治疗和应用效果更好。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及红细胞生成素/免疫球蛋白Fc融合蛋白及其合成方法和应用。
技术介绍
红细胞生成素是一种糖蛋白激素。它是骨髓内的红细胞母细胞刺激生长因子。体内绝大多数的红细胞生成素是由人的肾脏皮质分泌的，同时研究也发现在胚胎的肝脏，脑组织及子宫也产生红细胞生成素。由于肾脏内的肾小管毛细血管的间质细胞缺氧，因而刺激红细胞生长素的生成。至于红细胞生长素具体在肾脏什么细胞和部位合成，尚无明确的结论。一种假设是肾小管上皮细胞分泌红细胞生成素。由于贫血的血液是不能把氧从肾小管周围毛细血管输送到耗氧很高量的肾小管细胞，因而刺激了红细胞生成素的合成。如同其他的蛋白激素，红细胞生成素是通过与靶细胞浆膜上的红细胞生成素受体相结合而发生效用的，靶细胞即骨髓内的红细胞，母细胞被刺激而转化成熟为红细胞，如此增加了循环的红细胞数目。它反映在增加的红细胞容积，血红蛋白和红细胞计数上面。结果导致肾内氧水平的升高，而红细胞生成素减少。由于肾脏是红细胞生成素的主要来源，慢性肾功能衰竭通常造成红细胞生成素的缺陷，造成红细胞生成不足性贫血。红细胞生成素基因于1985年被成功的克隆并被成功的表达。目前已有人工基因合成的重组红细胞生成素用于临床，以刺激红细胞的生成并取代输血治疗由于慢性肾功能衰竭引起的贫血，以及由于其他疾病引起的红细胞生成障碍的疾病。
技术实现思路
本专利技术目的是用基因工程方法，将血红细胞生成素与免疫球蛋白Fc段基因相融合，提供一种基因重组合成红细胞生成素/免疫球蛋白Fc融合蛋白及其合成方法和临床应用，且为了保持或加强红细胞生成素的全部生物活性，同时延长其在体内的循环半衰期，简化生产提纯工序，并在哺乳动物细胞中得到表达。本专利技术目的是这样实现的红细胞生成素/免疫球蛋白Fc融合蛋白，这种新型的EPO/Fc融合蛋白基因结构，包括Human·CD5(或其他蛋白的)leading基因序列。其功能为启动EPO/Fc的转录，及分泌蛋白的转译。EPO/Fc基因包括了165个EPO成熟分泌蛋白的氨基酸基因序列，以及232个人免疫球蛋白IgG2Fc或IgGlFc段氨基酸的基因序列。完整的EPO/Fc的基因系列继而克隆进哺乳动物蛋白基因表达质粒pRc/CMV，表达质粒包括CMV起动子(promotor)，Poly-A序列，以及抗菌素耐药基因Genecin序列。全部成熟分泌的EPO/Fc蛋白为397个氨基酸。预计蛋白分子量为44.39KD(图1EPO融合蛋白的结构)。EPO/Fc融合蛋白为双体，由Fc的连接部Hinge的双硫键将两个单链EPO/Fc相结合，红细胞生成素/免疫球蛋白Fc融合蛋白合成方法，携带上述人EPO/Fc基因的质粒经电转进入了哺乳动物蛋白表达的细胞，通过NS.1小鼠的不分泌免疫球蛋白的骨髓瘤细胞株或中国，鼠卵巢细胞CHO进行细胞培养，并使用常规的蛋白A或蛋白B亲和层析柱的成熟分离蛋白的工艺进行蛋白的纯化。红细胞生成素/免疫球蛋白Fc融合蛋白应用用于慢性肾功能衰竭引起的贫血，以及红细胞生成障碍的疾病。本专利技术特点是创造出一种新型的EPO/Fc融合蛋白，并在哺乳动物细胞中得到表达。保持或加强红细胞生成素的全部生物活性，同时延长其在体内的循环半衰期，而且具有简化的生产提纯的工序，本专利技术的治疗和应用效果更好。附图说明图1是本专利技术红细胞生成素-免疫球蛋白Fc融合蛋白基因结构示意2是本专利技术免疫球蛋白Fc融合蛋白相增加糖蛋白成分的示意3是本专利技术小鼠体内小剂量注射后血清样本测定，其体内半衰期曲线具体实施方式如图所示，携带人EPO/Fc基因的质粒经电转进入了哺乳动物蛋白表达的细胞，NS.1(小鼠的不分泌免疫球蛋白的骨髓瘤细胞株)或CHO(中国，鼠卵巢细胞株)，通过结抗菌素Genetin的选择及多次的筛选挑出单克隆的高表达细胞株效果更好。由于EPO/Fc滴合蛋白具有Fc段，因而可以使用常规的蛋白A或蛋白B亲和层析柱的成熟分离蛋白的工艺进行蛋白的纯化。工艺成熟，分离纯度可高达99％以上，而且方法标准化，使生产成本大大降低。经SDS PAGE蛋白电泳分析，提纯的EPO/Fc融合蛋白为双体，由Fc的连接部Hinge的双硫键将两个单链EPO/Fc相结合，其分子量为130KD左右，其单链分子量为65KD左右。与其推测的44.39KD相增加部分为糖蛋白成分(图2所示)，其纯度超过99％。经小鼠体内小剂量注射后血清样本测定，其体内半衰期为30小时(图3所示)。由于测定采用双特异性酶免疫分析方法(ELISA)，第一抗体使用抗人IgGFc抗体，而检测第二抗体为抗人EPO抗体。此种方法能够特异性的测出EPO/Fc的浓度，而IgG或EPO单体则无干扰的可能性。进而使用EPO/Fc对小鼠的失血性贫血进行治疗，而对照的小鼠相比较EPO/Fc能够显著的增加红细胞容积及红细胞计数。如此我们创制出一种新型的EPO/Fc蛋白，其保留EPO的全部生物活性，且具有长半衰期，蛋白由哺乳动物细胞合成，糖蛋白及结构与天然蛋白相同，产量高，提纯工艺成熟，简单，成本低，适用于工业化大批量生产。权利要求1.红细胞生成素/免疫球蛋白Fc融合蛋白，其特征是EPO/Fc融合蛋白基因结构，起码包括人CD5leading基因序列，还包括EPO/Fc基因，EPO/Fc基因包括165个EPO成熟分泌蛋白的氨基酸基因序列，以及232个人免疫球蛋白IgG2Fc或IgG1 Fc段氨基酸的基因序列，EPO/Fc融合蛋白为双体，由Fc的连接部Hinge的双硫键将两个单链EPO/Fc相结合。2.红细胞生成素/免疫球蛋白Fc融合蛋白合成方法，其特征是将上述人EPO/Fc基因的质粒经电转进入了哺乳动物蛋白表达的细胞，通过NS.1小鼠的不分泌免疫球蛋白的骨髓瘤细胞株或中国鼠卵巢细胞CHO进行细胞培养，并使用常规的蛋白A或蛋白B亲和层析柱的成熟分离蛋白的工艺进行蛋白的纯化。3.红细胞生成素/免疫球蛋白Fc融合蛋白应用用于慢性肾功能衰竭引起的贫血，以及红细胞生成障碍的疾病。全文摘要红细胞生成素/免疫球蛋白Fc融合蛋白，EPO/Fc融合蛋白基因结构，起码包括人CD5leading基因序列，还包括EPO/Fc基因，EPO/Fc基因包括165个EPO成熟分泌蛋白的氨基酸基因序列，以及232个人免疫球蛋白IgG2Fc或IgG1Fc段氨基酸的基因序列，EPO/Fc融合蛋白为双体，由Fc的连接部Hinge的双硫键将两个单链EPO/Fc相结合。本专利技术创造出一种新型的EPO/Fc融合蛋白，并在哺乳动物细胞中得到表达。保持或加强红细胞生成素的全部生物活性，同时延长其在体内的循环半衰期，而且具有简化的生产提纯的工序，本专利技术的治疗和应用效果更好。文档编号A61P13/12GK1786032SQ20051009474公开日2006年6月14日 申请日期2005年10月10日 优先权日2005年10月10日专利技术者郑心校, 张辰宇 申请人:南京大学本文档来自技高网...
【技术保护点】
红细胞生成素／免疫球蛋白Ｆｃ融合蛋白，其特征是ＥＰＯ／Ｆｃ融合蛋白基因结构，起码包括人ＣＤ５ｌｅａｄｉｎｇ基因序列，还包括ＥＰＯ／Ｆｃ基因，ＥＰＯ／Ｆｃ基因包括１６５个ＥＰＯ成熟分泌蛋白的氨基酸基因序列，以及２３２个人免疫球蛋白ＩｇＧ２Ｆｃ或ＩｇＧ１Ｆｃ段氨基酸的基因序列，ＥＰＯ／Ｆｃ融合蛋白为双体，由Ｆｃ的连接部Ｈｉｎｇｅ的双硫键将两个单链ＥＰＯ／Ｆｃ相结合。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：郑心校，张辰宇，
申请(专利权)人：南京大学，
类型：发明
国别省市：84[中国|南京]
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