本发明专利技术公开了一种支链淀粉酶型淀粉去分支酶基因启动子及其应用。该启动子具有下述核苷酸序列：序列表中ＳＥＱ ＩＤ №：１或在高严谨条件下可与序列表中ＳＥＱ ＩＤ №：１限定的ＤＮＡ序列杂交的核苷酸序列。本发明专利技术的支链淀粉酶型淀粉去分支酶基因启动子可启动报告基因ｇｕｓＡ基因在种子中特异性表达，说明它能使目的基因在植物的种子中特异性表达，该启动子将在玉米种子改良和植物生物反应器中发挥重要作用。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种支链淀粉酶型淀粉去分支酶基因启动子及其应用。
技术介绍
随着植物分子生物学的飞速发展、植物遗传分析和遗传工程技术的不断革新，转基因植物在基础研究和生产实践上都具有重要意义。尤其是转基因植物生物反应器的研究和开发使植物能以极低的成本大量生产外源蛋白，为人类提供了一个更加安全和廉价的生产体系，与微生物发酵、动物细胞和转基因动物等生产系统相比，它具有许多潜在的优势和极大的商业价值。植物生物反应器是指以植物悬浮细胞、某一组织和器官或整株植物为工厂大量生产具有重要功能的蛋白。自1986至1990年间，人们建立了植物表达系统成功地表达了人类生长激素融合蛋白，干扰素和人血清白蛋白。之后，随着技术的发展，科学家对于植物生物反应器的研究渐趋深入，主要表现在三个方面首先是应用的广泛性。从生产植物抗体到口服疫苗到重要的药用蛋白，其分子的复杂程度和修饰度都在提高。自十几年前转基因烟草成功地表达免疫球蛋白的重链和轻链基因并组装成功能抗体以来，植物已经能够生产完整的IgG和IgA分子，分泌型IgG和IgA分子，双特异性抗体，膜锚定抗体等不同类型抗体。目前已经实现的口服疫苗包括细菌疫苗、病毒疫苗、寄生虫疫苗等；第二是可用做反应器的植物种类的扩展。从最初的模式植物烟草，到现在的马铃薯、番茄，玉米，油菜，大豆，拟南芥，香蕉，番木瓜，豇豆，菠菜，苜蓿、芜青等。Elizabeth E Hood报道的用转基因玉米生产的重组抗生素蛋白的表达量占种子中抽提的总可溶蛋白的2％，在目前表达外源蛋白的所有转基因玉米中表达量最高；第三实现植物生物反应器的技术改良。如，提高蛋白表达水平，人们在叶绿体内合成复杂的需要翻译后加工的或亚基装配的真核蛋白质，如sIgA；整合到烟草叶绿体基因组中的外源基因拷贝数能够达到每个细胞10000个拷贝，相应的重组蛋白占全部可溶性蛋白的比例也提高到47％。转基因植物生物反应器研究使农业这一概念大大拓宽，突破了传统农业范畴，但要使外源基因在植物中稳定的整合，并且能够在特定的器官或细胞中特异性表达，一个很重要的前提条件是要有合适的启动子。植物基因工程中常用的启动子按其作用方式及功能可分为三类组成型启动子、组织特异型启动子和诱导型启动子。组织特异性启动子，可以使基因的表达仅限于某些特定的器官或组织部位，并降低对植物的负面影响。目前，在植物中发现的种子特异性启动子主要有谷醇溶蛋白基因启动子、花生种子豆球蛋白legA基因启动子、水稻谷蛋白gluA和gluB基因启动子和玉米醇溶蛋白基因启动子等。玉米淀粉的合成途径中有许多相关酶，其中玉米淀粉去分支酶有两种类型一种是支链淀粉酶型去分支酶(the pullulanase-type DBEs)，一种是异淀粉酶型去分支酶(the isoamylase-type DBEs)。ZPU1是一种支链淀粉酶型淀粉去分支酶，在不同玉米组织中检测Zpu1基因转录的mRNA，发现在玉米授粉20天后种子胚乳中大量存在，而在胚和穗中只有微量的表达，但在叶和根中没有表达。说明调控Zpu1基因的调控序列可能是胚乳特异性或种子特异性的。而且该基因只在胚乳、幼胚和穗中表达，也即只在生殖组织中表达，表明该基因的调控序列可能存在与生殖相关的功能区域。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种支链淀粉酶型淀粉去分支酶基因启动子。本专利技术所提供的支链淀粉酶型淀粉去分支酶基因启动子，是玉米淀粉合成途径中的支链淀粉酶型淀粉去分支酶Zpu1基因的启动子，具有下述核苷酸序列序列表中SEQ ID №1或在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID №1限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。所述高严谨条件为杂交后用含1×SSC、0.1％SDS的溶液在65℃下洗膜。具有序列表中SEQ ID №1的核苷酸序列的启动子名称为zpu1P-4，由516个碱基组成。含有本专利技术的支链淀粉酶型淀粉去分支酶基因启动子的载体、细胞系及宿主菌均属于本专利技术的保护范围。扩增本专利技术启动子任一片段的引物对也属于本专利技术的保护范围。实验证明，本专利技术的支链淀粉酶型淀粉去分支酶基因启动子可启动报告基因gusA基因在种子中特异性表达，说明它能使目的基因在植物的种子中特异性表达，该启动子将在玉米种子改良和植物生物反应器中发挥重要作用。附图说明图1为RT-PCR扩增得到的用于筛库的片段的电泳图谱图2A为第一轮筛选玉米基因组文库的杂交显影的X光片扫描2B为第二轮筛选玉米基因组文库的杂交显影的X光片扫描2C为第三轮筛选玉米基因组文库的杂交显影的X光片扫描2D为第四轮筛选玉米基因组文库的杂交显影的X光片扫描2E为验证第三轮和第四轮筛选得到的单克隆杂交显影的X光片扫描3A为lambda DNA的酶切电泳图谱图3B为lambda DNA酶切后的杂交图谱图4为用PCR扩增得到的Zpu1基因启动子序列zpu1P-4图5为zpu1P-4片段构建到真核表达载体pBI121上的图谱示意图具体实施方式材料与方法1、菌株与质粒大肠杆菌(E.coli)DH5α、农杆菌LBA4404均购自博大公司、λ噬菌体的宿主菌LE392购自Clontech公司。2、工具酶及生化试剂各种限制性内切酶、pGEM@T-Easy载体试剂盒购自Promega公司；普通Taq酶和Trizol RNA小量提取试剂盒购自天为时代公司，ExTaq酶购自Takara公司；dNTP混合物购自上海生工；T4DNA连接酶购自Takara公司和BioLabs公司；萘乙酸(NAA)、氨苄青霉素(Amp)、卡那霉素(Km)、链霉素(Sm)和噻孢霉素(Cef)购自欣经科公司；同位素α-32P dCTP购自北京亚辉生物公司；硝酸纤维素膜购自Amersham公司。4-甲基伞型酮(4-MU)、4-甲基伞型酮酰-β-葡萄糖醛酸酐酶(4-MUG)均购自上海生工。3、培养基LB液体培养基(1升)10g NaCl，5g酵母提取物，10g胰蛋白胨，pH7.0LB固体培养基(1升)1升液体LB培养基加15g琼脂YEB液体培养基(1升)1g酵母提取物，10g蛋白胨，0.5g MgSO4·7H2O，5g蔗糖，pH 7.5YEB固体培养基(1升)1升YEB液体培养基加15g琼脂MS基本培养基(1升)MS大量元素，MS微量元素，MS有机物，各组份的基本成分参照Murashige，T&Skoog，F.在1962发表的MS培养基成分(Murashige，T&Skoog，F.A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissueculture.Physiol.Plant.1962，15473-497)MS盐溶液只含有MS大量元素和微量元素MS固体培养基1升MS基本培养基中加30g蔗糖，8g琼脂，pH5.6-5.8烟草分化固体培养基1升MS基本培养基中加30g蔗糖，8g琼脂，3mg 6-BA，0.2mgNAA，pH 5.6-5.8烟草诱导生根培养基1升MS基本培养基加30g蔗糖，8g琼脂，pH5.6-5.84.筛选基因组文库所需溶液1)20×SSC175.3gNaCl(3.0M)88.2g 柠檬酸三钠(0.3M)用NaOH调pH至7.0，定容至1升，室温保存备用。2)2本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种支链淀粉酶型淀粉去分支酶基因启动子，具有下述核苷酸序列：序列表中ＳＥＱＩＤ№：１或在高严谨条件下可与序列表中ＳＥＱＩＤ№：１限定的ＤＮＡ序列杂交的核苷酸序列。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：王国英，陈小平，王章英，王建华，
申请(专利权)人：中国农业大学，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]
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