猪凝血酶的制备方法技术

本发明专利技术公开一种猪凝血酶的制备方法；材料是猪血与猪脑；制备包括：（１）猪血浆的制备；（２）猪凝血酶原活酶复合物的制备；（３）猪凝血酶的制备。本发明专利技术的猪ＦＶ的收率高于Ｍｉｃｈａｅｌ、Ｋａｔｚｍａｎｎ和Ｐｒｙｚｄｉａｌ报道的牛ＦＶ的收率；猪ＦＸａ的收率高于Ｊｏｓｅｐｈ、Ｋａｌａｆａｔｉｓ、Ｒｏｂｅｒｔ等人报道的牛ＦＸａ的收率，本工艺简单、纯化步骤少；利于大规模化生产。经济价值可观。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术是一种用于止血剂---凝血酶的制备方法。
技术介绍
1892年，Schmidt用乙醇从新鲜血浆中制备了凝血酶。国外研究主要致力于人、牛凝血酶的制备；制备方案主要是先制备凝血酶原，再激活，最后获得凝血酶。其原因是凝血酶非常不稳定，而凝血酶原非常稳定。此方案可避免制备过程中凝血酶的大量损失；早期制备方法主要是等电点沉淀和饱和硫酸胺盐析等。例如，Mellanby(1933)将血浆稀释并酸化至pH 5.3制得了凝血酶原，静置自发生成凝血酶。Astrup(1941)用同种方法制备凝血酶原，采用牛肺凝血活酶和Ca2+活化凝血酶原。Seeger(1950)改进了凝血酶的制备工艺，采用氢氧化镁吸附和饱和硫酸胺盐析等方法制备凝血酶原，采用25％柠檬酸钠活化凝血酶原。上述方法制备的优点是操作简单、收率高；缺点是激活效率低、纯度低。随着生化制备技术的不断发展，凝血酶的制备工艺得到大幅度改进，主要采用吸附、层析、超滤的方法。如Aronson(1966)采用柠檬酸钡吸附、硫酸铵分级沉淀、等电点沉淀、IR-50层析纯化凝血酶原。Lunblad(1971)采用SE-Sephadex C-50和SP-Sephadex C-50离子交换等方法纯化牛凝血酶也获得成功。Whyte(1974)采用QAE-SephdexQ-50和Sephadex G-100层析制备凝血酶活性可达1240±200U/mg。至今国外仍延续这些凝血酶原制备工艺和激活方法。但是采用这些方法制备的凝血酶大都用于科研，很难用于规模化生产。原因是操作步骤多、操作条件复杂，难于控制；损失量大造成的成本高，收率低。凝血酶原的制备方法逐渐成熟的同时，其激活方法也日臻完善。Whyte(1974)采用凝血酶原活酶复合物活化牛凝血酶原获得成功，并分析了此复合物活化牛凝血酶原的产物成分。在体内，凝血酶原活酶复合物是内、外血凝共同通路中活化凝血酶原的物质，可迅速将凝血酶原激活成活性高，稳定性好的α-凝血酶。相对国外而言，国内凝血酶制备研究起步较晚。在相当长的时期内一直沿用Mellanby(1933)的制备工艺，并将其用于猪凝血酶的制备。但在激活方法上始终没有突破，仍采用高浓度的Ca2+激活。近年来国内也相继采用Aronson(1966)方法制备人、猪凝血酶原，激活剂主要是动物脑组织或肺组织提取液。例如，李征(1998)采用CM-纤维素离子交换层析制备人凝血酶原，采用胰酶激活凝血酶原，酶相对比活为12.3U/mg，未说明收率。欧伶(1997)SephadexG-75层析制备猪凝血酶原，兔脑粉激活凝血酶原，酶相对比活26.6U/mg，收率为41％。肖丽霞(1999)将DEAE-纤维素和SephadexG-100层析结合制备猪凝血酶原，高浓度的Ca2+激活凝血酶原，酶相对比活达到了2000U/mg，收率为56％。但孙文种(2002)单纯采用CM-Sepharose离子交换层析制备人凝血酶原，兔脑提取液激活，酶相对比活就达到1951U/mg，收率可达77.9％。从我国凝血酶制备现状来看，人们只是试图优化凝血酶原的制备方法，而凝血酶原激活方法一直没有突破。因此各种凝血酶制备效果差异非常大，反映出这些工艺的不稳定性，也限制了这些制备工艺实际应用。
技术实现思路
本专利技术目的是公开一种；本专利技术制备方法的工艺过程为材料是猪血与猪脑；试剂牛血清白蛋白(BSA)；纤维蛋白原(Fibrinogen)；DEAE-纤维素(DEAE-cellulose)；凝血酶活性测定试剂盒；和通用的生化试剂或分析纯试剂。试剂、溶液按照生物化学与分子生物学相关说明书配制。(1)猪血浆的制备向收集新鲜猪血中按1∶9比例加入3.8％的柠檬酸钠抗凝剂和一定浓度的抑制剂。4℃下，4000r/min离心30min沉降红细胞，吸出血浆，置-20℃冻存备用。(2)猪凝血酶原活酶复合物的制备(2.1)猪凝血因子V(FV)的制备采用聚乙二醇(PEG)沉淀、柠檬酸钡吸附、DEAE-纤维素离子交换层析方法制备。(2.2)猪激活凝血因子X(Fxa)的制备采用柠檬酸钡吸附、EDTA解吸附、硫酸铵分级沉淀、DEAE-纤维素离子交换层析、胰蛋白酶激活方法制备。(2.3)猪脑磷脂的制备取猪脑，除去脑膜和血块，称取10g，匀浆，加入3倍量丙酮于4□浸泡24h，滤渣干燥。再加入3倍量乙醚于4□浸泡24h，合并滤液回收乙醚，浓缩物再以丙酮洗涤2～3次，得猪脑总磷脂。总磷脂中加入少量95％热乙醇，4□浸泡24h，收集沉淀，即为猪脑磷脂。(3)猪凝血酶的制备(3.1)猪凝血酶原的制备取新鲜血浆100mL，用蒸馏水稀释10倍，用1％醋酸调pH5.0使蛋白质等电沉淀。静置过夜，然后置于离心机中，以3000r/min离心15min。弃上清取沉淀用20mL 0.9％氯化钠溶解，再置于离心机中以3000r/min离心15min，上清液即为凝血酶原粗品。(3.2)猪凝血酶原的激活采用猪凝血酶原活酶复合物(FV、FXa、猪脑磷脂、Ca2+体系)激活猪凝血酶原，获得猪凝血酶。本专利技术的猪FV的收率高于Michael(1978)、Katzmann(1983)和Pryzdial(1991)报道的牛FV的收率；猪FXa的收率高于Joseph(1978)、Kalafatis(1994)、Robert(1996)等人报道的牛FXa的收率，本工艺简单、纯化步骤少；利于大规模化生产。具体实施例方式猪凝血酶的用途广泛在临床上凝血酶可作为局部止血药，用于手术中不易结扎小血管的止血，外伤止血、骨出血、扁桃体摘除、拔牙等止血；可口服，用于胃和十二指肠出血；用于肝脏实质性出血和骨髓出血止血有显著效果。在治疗重型肝炎、肝炎后肝硬化、上消化道出血，有效率可达96.3％。相对传统止血药剂，凝血酶具有不可比拟的优点1.止血速度快，疗效确切。2.应用范围广，毛细血管、小血管及实质性脏器出血均可应用。3.用药方便、安全，可口服或局部喷洒、涂布、直接作用于出血部位，不干扰体内凝血功能。4.对凝血机能障碍者，如血小板减少性紫癜、高血压及慢性肝炎伴凝血功能低下者，仍有良好止血效果。5.长期、反复及大剂量应用均无明显不良反应，无毒副作用，无刺激性。6.有助于组织修复，加速创面愈合。上述优点已使凝血酶在发达国家畜牧业生产和医疗领域中得到广泛应用。还可以应用到基因工程研究工作中。目前利用基因工程在原核系统中表达外源短肽时，常常要构建成融合蛋白的形式，以增强表达产物的稳定性，提高表达效率。表达后可采用化学法和蛋白酶法将融合蛋白切开。化学法虽简便易行，效率高，但对目的蛋白中的氨基酸种类有要求，且需使用一些对生物体造成危害的化学试剂(如CNBr)，因而限制了它的应用。目前应用最多的是专一地切割肽链的蛋白酶，由于凝血酶是一种具有高度特异性的丝氨酸蛋白酶，将融合蛋白的接合位点设计成凝血酶的特异性酶切位点，就可以将融合蛋白切开，得到目的蛋白。同时随着我国畜牧业、珍稀动物繁殖业、宠物养殖业、生物制药业等行业的发展，动物疾病治疗、动物外科手术及动物外伤处理已越来越多，止血药物在临床应用十分紧俏，需求量较大。凝血酶恰好可以弥补传统药物的缺点，如临床领域使用的止血药止血环酸、止血敏、维生素K等，这些药物均是通过刺激毛细血管和微小动脉收缩而达本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种猪凝血酶的制备方法；工艺过程为：材料是猪血与猪脑；试剂：牛血清白蛋白（ＢＳＡ）；纤维蛋白原（Ｆｉｂｒｉｎｏｇｅｎ）；ＤＥＡＥ－纤维素（ＤＥＡＥ－ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ）；凝血酶活性测定试剂盒；和通用的生化试剂或分析纯 试剂；试剂、溶液按照生物化学与分子生物学相关说明书配制；（１）猪血浆的制备向收集新鲜猪血中按１∶９比例加入３．８％的柠檬酸钠抗凝剂和一定浓度的抑制剂；４℃下，４０００ｒ／ｍｉｎ离心３０ｍｉｎ沉降红细胞，吸出血浆，置－２０℃冻 存备用；（２）猪凝血酶原活酶复合物的制备（２．１）猪凝血因子Ｖ（Ｆ）的制备采用聚乙二醇（ＰＥＧ）沉淀、柠檬酸钡吸附、ＤＥＡＥ－纤维素离子交换层析方法制备；（２．２）猪激活凝血因子Ｘ（Ｆｘａ）的制备　采 用柠檬酸钡吸附、（乙二胺四乙酸二钠盐）ＥＤＴＡ解吸附、硫酸铵分级沉淀、ＤＥＡＥ－纤维素离子交换层析、胰蛋白酶激活方法制备；（２．３）猪脑磷脂的制备取猪脑，除去脑膜和血块，称取１０ｇ，匀浆，加入３倍量丙酮于４□浸泡２４ｈ，滤渣 干燥；再加入３倍量乙醚于４□浸泡２４ｈ，合并滤液回收乙醚，浓缩物再以丙酮洗涤２～３次，得猪脑总磷脂；总磷脂中加入少量９５％热乙醇，４□浸泡２４ｈ，收集沉淀，即为猪脑磷脂；（３）猪凝血酶的制备（３．１）猪凝血酶原的制备 取新鲜血浆１００ｍＬ，用蒸馏水稀释１０倍，用１％醋酸调ｐＨ５．０使蛋白质等电沉淀；静置过夜，然后置于离心机中，以３０００ｒ／ｍｉｎ离心１５ｍｉｎ；弃上清取沉淀用２０ｍＬ０．９％氯化钠溶解，再置于离心机中以３０００ｒ／ｍｉｎ离心１５ｍｉｎ，上清液即为凝血酶原粗品；（３．２）猪凝血酶原的激活采用猪凝血酶原活酶复合物（ＦＶ、ＦＸａ、猪脑磷脂、Ｃａ↑［２＋］体系）激活猪凝血酶原，获得猪凝血酶。...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：高学军，张强，李庆章，于艳波，
申请(专利权)人：东北农业大学，
类型：发明
国别省市：93[中国|哈尔滨]