本发明专利技术公开了抑制多效生长因子基因表达的小干扰ＲＮＡ及其应用，其目的是提供抑制多效生长因子基因表达的小干扰ＲＮＡ与其作为肿瘤治疗性药物的应用。该小干扰ＲＮＡ是正义链为序列表中的ＳＥＱ ＩＤ №：１，反义链为序列表中ＳＥＱ ＩＤ №：２的双链ＲＮＡ序列。其编码序列是下述双链核苷酸序列：正义链具有序列表中ＳＥＱ ＩＤ №：３的核苷酸序列；反义链具有序列表中ＳＥＱ ＩＤ №：４的核苷酸序列。本发明专利技术在医学和生物制药领域具有较大的实际意义和广阔的应用前景。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及小干扰RNA及其应用，特别是涉及抑制多效生长因子(Pleiotrophin)基因表达的小干扰RNA及其作为肿瘤治疗药物的应用。
技术介绍
多效生长因子(Pleiotrophin，Ptn)是1989年从围产期鼠脑组织中纯化而来的，研究表明Ptn也存在于一些非神经组织中，如子宫、心脏、软骨等。它能够促进轴突生长，刺激细胞的增殖与迁移，促进血管生成，促进神经系统及骨的发育等。Ptn蛋白具有2个β-sheet(β-折叠)结构域，通过易折叠的linker相连，每个β-折叠结构域又含有3个呈反平行的β-链，N端和C端富含赖氨酸，形成袖口样形状。最近的研究表明肺癌、结肠癌、胃癌等肿瘤患者血清中Ptn的水平明显高于正常对照，尤其在肿瘤的早期阶段更为显著。Ptn在其信号传导通路中有四个受体，分别为N-syndecan、PTPξ、ALK和LRP。Ptn与N-syndecan结合，可以促进轴突生长；与PTPξ结合，可以使磷酸化的PTPξ失活，最终导致β-catenin酪氨酸磷酸化；与ALK结合，可以促进细胞的锚着独立性生长能力；LRP是一种膜蛋白，Ptn与其结合，可以抗凋亡。肿瘤抑制基因PTEN在多种进展期肿瘤组织中，如脑肿瘤、乳腺癌、子宫内膜癌、前列腺癌、膀胱癌、甲状腺癌等都存在着不同程度的突变或丢失，它是人类肿瘤中突变率最高的基因之一。PTEN基因位于染色体10q23.3，作为脂质磷酸酶，PTEN下调PI3K/AKT通路，调控细胞周期进展和细胞凋亡；作为蛋白磷酸酶，PTEN具有抑制MAPK信号通路的作用。本专利技术的专利技术人通过基因芯片杂交发现正常小鼠胚胎成纤维细胞系和PTEN缺失的胚胎成纤维细胞系之间的基因表达存在差异，Northern杂交证实在PTEN缺失的胚胎成纤维细胞系中Ptn高表达，并发现在血小板衍生生长因子(PDGF)的刺激下，Ptn的表达增强。用LY294002抑制PI3K后，Ptn的表达明显下降，并且PTEN缺失后，Akt的高表达可导致Ptn的表达增强。上述研究表明抑制Ptn的表达水平可能会对Pten缺失的肿瘤起到抑制作用，提示Ptn可作为治疗具有Pten基因突变的肿瘤的药物靶标。近年发展起来的RNA干涉技术为成功抑制Ptn基因的表达提供了一种便捷、有效的手段。RNA干扰(RNA interference，简称RNAi)是通过小分子双链RNA(ds RNA)特异性互补结合靶向基因转录本，从而导致基因转录后沉默的一种技术。具有基因沉默作用的小分子双链RNA的长度通常为21-23nt，又被称为小干扰RNA(siRNA，smallinterfering RNA)，这些小片段会进一步介导与其同源的单链RNA降解。siRNA结构稳定，无须像反义核苷酸那样进行广泛的化学修饰以提高其半衰期，并能在低于反义核苷酸几个数量级的浓度下，使靶基因降低至极低水平甚至完全“敲除”。siRNA的干预效应关键取决于其靶基因序列的选择，任一nt的错误均会导致RNAi效应的丧失，这种高度序列特异性使其具有重要的药理学价值。已证实，RNA干扰技术可单独或与其它现有的治疗手段一同用于某些疾病的治疗，如病毒感染，肿瘤等。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一对能有效抑制多效生长因子基因表达的小干扰RNA。本专利技术所提供的抑制多效生长因子基因表达的小干扰RNA，是正义链为序列表中的SEQ ID №1，反义链为序列表中的SEQ ID №2的双链RNA序列。将上述双链RNA序列命名为Ptn siRNA，其反义链与Ptn mRNA的243-261位置序列互补。序列表中SEQ ID №1由21个碱基组成，序列的方向从左至右为5′端→3′端；序列表中SEQ ID №2由21个碱基组成，序列的方向从左至右为5′端→3′端。编码上述抑制多效生长因子基因表达的小干扰RNA的序列也属于本专利技术的保护范围。它具有下述双链核苷酸序列正义链(不做模板的DNA链)具有序列表SEQ ID№3的核苷酸序列；反义链(做模板的DNA链)具有序列表中SEQ ID №4的核苷酸序列。序列表中SEQ ID №3由64个碱基组成，序列的方向从左至右为5′端→3′端；序列表中SEQ ID №4由64个碱基组成，序列的方向从左至右为3′端→5′端。含有抑制多效生长因子基因表达的小干扰RNA编码序列的表达载体、转基因细胞系和宿主菌以及扩增抑制多效生长因子基因表达的小干扰RNA编码序列中任一片段的引物也属于本专利技术的保护范围。本专利技术的另一个目的是提供一种抑制多效生长因子基因表达的方法。本专利技术所提供的抑制多效生长因子基因表达的方法，是将上述含有抑制多效生长因子基因表达的小干扰RNA编码序列的载体导入宿主中，多效生长因子基因的表达得到抑制。所述抑制多效生长因子基因表达的小干扰RNA的编码序列可通过含有所述抑制多效生长因子基因表达的小干扰RNA的编码序列的siRNA干扰载体导入宿主；用于构建所述siRNA干扰载体的出发载体可为任意一种可在宿主中表达外源siRNA的载体，如pSilencerTM3.1-H1(购自美国Ambion公司，物理图谱如附图说明图1所示)。以pSilencerTM3.1-H1为出发载体，构建的siRNA表达载体为pPtn-siRNA B。本专利技术提供了一对抑制多效生长因子基因表达的小干扰RNA。实验证明，本专利技术的小干扰RNA对Ptn基因具有显著的抑制作用，此外，通过沉默Ptn基因，可以抑制PTEN基因缺失细胞的增殖，表明Ptn可以作为治疗具有PTEN基因突变的肿瘤的药物靶标。因此可以以抑制多效生长因子基因表达的小干扰RNA的编码序列作为活性成分制备成肿瘤治疗性药物。本专利技术在医学和生物制药领域具有较大的实际意义和广阔的应用前景。下面结合具体实施例对本专利技术作进一步说明。说明书附1为载体pSilencerTM3.1-H1的物理图谱图2为Northern印迹检测不同siRNA对Ptn基因表达抑制能力的结果图3为Northern印迹筛选Ptn被稳定沉默的Pten-/-MEF241细胞克隆的结果图4为抑制Ptn基因的表达对Pten-/-MEF241细胞生长影响的检测结果具体实施方式下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，所用引物由美国应用生物系统的DNA自动合成仪合成。实施例1、抑制多效生长因子基因表达的siRNA干扰载体的构建根据多效生长因子基因的mRNA序列设计其siRNA序列，得到三条双链RNA序列，分别命名为Ptn-siRNA A、Ptn-siRNA B、Ptn-siRNA C，序列如下Ptn-siRNA A正义链5’-aaagucugacuguggagaaug-3’反义链5’-cauucuccacagucagacuuu-3’；Ptn-siRNA B正义链5’-aagacucagagauguaagauc-3’(序列表中SEQ ID №1)反义链5’-gaucuuacaucucugagucuu-3’(序列表中SEQ ID №2)；Ptn-siRNA C正义链5’-aaugugaccucaauaccgccu-3’反义链5’-aggcgguauugaggucacauu-3’。再根据上述三条Ptn siRNA序列合成构建抑制多效生长因子基因表达的siRNA 干扰载体所需的D本文档来自技高网...
【技术保护点】
抑制多效生长因子基因表达的小干扰ＲＮＡ，是正义链为序列表中的ＳＥＱＩＤ№：１，反义链为序列表中ＳＥＱＩＤ№：２的双链ＲＮＡ序列。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：李刚，胡迎春，霍艳英，吴德昌，
申请(专利权)人：中国人民解放军军事医学科学院放射与辐射医学研究所，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]
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