一种哺乳动物体细胞核移植方法技术

本发明专利技术提供了一种哺乳动物体细胞核移植方法，其主要特点在于以哺乳动物的杂交Ｆ１代的卵母细胞作为受体细胞进行核移植。本发明专利技术的方法能够显著地提高哺乳动物核移植受体胞质的重编程能力，改善重构胚的发育，从而提高体细胞克隆效率。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及转基因动物技术、胚胎工程与发育生物学领域。具体地说，是关于。
技术介绍
动物克隆技术是将供体体细胞核经显微手术和/或细胞融合的方法移植到去核卵母细胞胞质中，重新组成胚胎(重构胚)。重构胚经培养发育至囊胚，再将囊胚移植到同步发情的寄母子宫内，待发育成熟后分娩出动物，该动物被称为“克隆动物”，该技术则被称为“体细胞克隆技术”或“体细胞核移植技术”(Nuclear transfer，NT)。哺乳动物体细胞克隆技术经过几年的发展，业已取得了很大进展，相继诞生了绵羊、山羊、牛、猪、鼠、猫、兔等克隆动物，为家畜良种繁育、濒危动物拯救、生产异种器官移植所需的供体器官以及人类疾病的治疗等开辟了广阔的空间。但是，目前的克隆效率仍很低，而且克隆动物出生前后会出现许多异常，如克隆胚胎发育阻滞、胎盘异常、流产率高、出生个体体重过重及致畸率高等(Han YM，Kang YK，Koo DB.Theriogenology，2003，59(1)33～44)。这些问题极大地限制了克隆技术的应用和发展。我们知道，在正常受精过程中，卵母细胞接受精子，相互识别，启动胚胎发育；而在核移植技术中移入卵母细胞胞质的则是已分化的体细胞核，其基因组状态与精子有很大差异，卵母细胞对其的“识别”会发生困难，进而导致重编程的失败或不完全，克隆胚胎无法完成发育。因此，作为重构胚受体胞质的卵母细胞对供体核的重编程的能力，是影响核移植效率的重要因素之一。然而，许多实验室开展的克隆牛工作很大程度上受到了实验材料卵巢来源的制约。由于这些卵巢大都取材于屠宰场，无法评价提供卵巢的牛的性状和生理功能等情况，更无从了解其遗传背景。同时，来自不同遗传背景的受体细胞，它的胞质结构成分也会有所不同。卵母细胞胞质中结构成分的不同主要表现为细胞胞质内DNA类型的多样性和细胞质内环境的差异。不同的DNA组成及内环境的差异会影响核移植的重构胚的分裂及其后续的发育。以往的一些实验已经证明了杂交F1代的卵母细胞在胚胎发育上的优势。在转基因动物的生产上，用杂交系比用近交系C57BL/6小鼠的效率高8倍；在孤雌激活的实验上，以(B6D2)F1的卵母细胞孤雌激活的胚胎其囊胚孵化率高于以近交系C57BL/6的卵母细胞孤雌激活的胚胎。这可能主要与杂交卵母细胞的杂交优势有关。任何一个杂交个体都有可能比其父母具有更高的生产能力。当两个纯种杂交时，我们将获得具有更高杂交遗传力的杂交体。一个实验从分子水平证实了杂交卵母细胞杂交优势的存在。利用双向蛋白凝胶电泳比较DBA/2和C57BL/6的卵母细胞发现，至少有17种蛋白存在着合成上的区别。而所有的这些蛋白在上两种品系的杂交(B6D2)F1代的卵母细胞上都能合成并且有的合成率还更高，其中在DBA/2也有合成的两种蛋白还被认为极有可能是卵母细胞修饰因子(Latham KE et al.Development，1994；120(12)3419-26)。其机制可能与两品系间等位基因表达水平的不同和印迹基因的不同有关。众所周知，体细胞被移入卵母细胞后必须尽快地被重编程以表达胚胎早期发育所需的基因，而正是卵母细胞胞质中的重编程因子具有去除细胞原有记忆的能力。因此，杂交卵母细胞杂交优势的遗传多样性使其具有较高的重编程能力，在卵子形成期和成熟期杂交卵母细胞将不仅在种类上而且在数量上合成较多的重编程因子来改善重构胚的发育，从而提高体细胞克隆效率。已有许多研究试图通过选择不同的受体卵母细胞来改善克隆胚的发育(Betthauser J，et al.Nat.Biotechnol.，2000，18(10)1055-9；Bondioli K，et al.Mo1.Reprod.Dev.，2001，60(2)189-95；Miyoshi K，et al.Biol.Reprod.，2002，67(2)540-5)，如MII期卵母细胞和MI期卵母细胞的对比；体外成熟和体内成熟卵母细胞的对比以及来源于青春期前的动物和成体动物的卵母细胞的对比等等。但迄今为止，尚未见有用杂交F1代的卵母细胞作为受体细胞进行哺乳动物克隆的报道。
技术实现思路
本专利技术的目的就在于利用杂交F1代卵母细胞在胚胎发育上的优势，从而提供。本专利技术的专利技术人经过研究发现，利用哺乳动物的杂交F1代卵母细胞作为受体细胞可以有效地提高受体胞质卵母细胞的重编程能力，改善重构胚的发育，进而提高动物核移植胚胎的早期发育率。因此，本专利技术的哺乳动物体细胞核移植方法的最主要的特点在于以哺乳动物的杂交F1代的卵母细胞作为受体细胞进行核移植，具体包括以下步骤 A、取哺乳动物体细胞制备供体核细胞；B、取杂交F1代的卵母细胞作为受体细胞；C、对杂交F1代的卵母细胞进行核去除；D、将供体细胞核注入去核的卵母细胞后融合。其中，步骤A所述哺乳动物体细胞可以取自牛、羊、猪、狗、猫、兔、猴或小鼠的组织、器官的细胞、体外培养的细胞及遗传修饰过的细胞。优选地，所述供体核细胞为遗传背景清楚的母牛的成纤维细胞或卵丘细胞。步骤B的杂交F1代卵母细胞的母本与供体核细胞为同一品系，优选地，所述卵母细胞为F1代杂交牛通过活体取卵(ovum pick up，OPU)的方法获得的新鲜卵母细胞；步骤D中，使用胞质内注射法将供体核细胞注入卵母细胞卵周隙，然后通过融合法融入卵母细胞。本专利技术的哺乳动物体细胞核移植方法具有下列优点1、利用杂交F1代的杂交优势，以F1代杂交牛的卵母细胞为受体胞质，提高了受体胞质的重编程能力，从而改善了重构胚的发育，提高体细胞克隆效率。将在一定程度上解决目前国际上体细胞克隆效率低下的难题，建立高效的体细胞核移植技术平台；2、利用杂交卵母细胞细胞质核移植技术，不仅在囊胚的数量，而且在囊胚的质量上都有显著的提高。具体实施例方式为了便于理解本专利技术，特列举以下实施例。其作用应被理解为是对本专利技术的诠释而并非对本专利技术的任何方式的限制。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如实验室手册(New YorkCold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实验材料与方法以下实施例中所使用的实验试剂，除另有说明外均为美国Sigma公司产品。本实施例选取已建立发情周期的青年荷斯坦奶牛、黄牛和F1代杂交牛(荷斯坦母牛×黄种公牛)进行分组，分别为荷斯坦奶牛组、黄牛组和F1代杂交牛组。开始实验时年龄为12-13个月，体重和体况相似。本实施例中采用荷斯坦奶牛的卵丘细胞作为供体核细胞，而以F1代杂交牛(荷斯坦母牛×黄种公牛)的卵母细胞作为受体卵母细胞，并同时以荷斯坦奶牛和黄牛的卵母细胞作为对照。实施例1、供体核细胞的制备取荷斯坦奶牛1～5代的卵丘细胞或成纤维细胞用加10％胎牛血清(FBS)的D-MEM/F-12(Gibco，Grand Island，NY)进行培养，细胞生长至瓶底80～90％时，将培养液换成含0.5％FBS的培养液血清饥饿2～3天。然后用0.25％的胰蛋白酶消化约3分钟贴壁细胞，将消化下来的细胞洗涤2遍后，加入适量的TCM199+10％FBS反复吹打成单个细胞的悬液，即得到供体核细胞待用。实施例2、受体卵母细胞的准备对各实验组的牛进行活体取卵获得卵母细胞，活体取卵的具本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种哺乳动物体细胞核移植方法，其特征在于，所述核移植方法以哺乳动物的杂交Ｆ１代的卵母细胞作为受体细胞。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：曾溢滔，杨晓煜，黄淑帧，
申请(专利权)人：上海交通大学附属儿童医院，上海滔滔转基因工程股份有限公司，
类型：发明
国别省市：31[中国|上海]