基于AquaOBP4的绿色植物源榆紫叶甲野外诱捕器设计制造技术

本发明专利技术属于农业病虫害防御技术，具体涉及一种绿色植物源的榆紫叶甲野外诱捕器装置。该装置主要由防雨盖、透明挡板、集虫装置和诱剂存放罐组成，本发明专利技术最关键的一部分是诱剂存放罐中诱剂成分的确定，我们对榆紫叶甲生境中的40种相关化合物进行荧光竞争结合实验，初步筛选出五种化合物，再通过构建AquaOBP4蛋白分子结构模型，根据其空间结构及结合特点，进一步确定了三种化合物，再经过EAG和行为学验证最终确定了与AquaOBP4较强结合的化合物为Dibutyl phthalate，将这种化学试剂存放在诱剂存放罐中，当榆紫叶甲在诱剂气味的刺激下会飞扑过来，成功撞到透明挡板上，然后掉入下方的集虫装置中。本发明专利技术运营成本低，对环境无污染，而且受环境影响小，大规模防治时也可以起到很好的控制效果，该装置可独立使用，也可形成综合的防治系统。

The design of green plant source of ambrostomaquadriimopressum field trap based on AquaOBP4

【技术实现步骤摘要】
基于AquaOBP4的绿色植物源榆紫叶甲野外诱捕器设计
：本专利技术属于农业病虫害防御技术，具体涉及一种榆紫叶甲野外诱捕装置。
技术介绍
榆树，属榆科榆属落叶乔木。因其生长迅速、繁殖力强、适应性广，既耐寒冷、干旱、瘠薄，又耐盐碱，是北方植树造林、防风固沙、生态防护的主要树种。近年来由于榆紫叶甲猖獗发生，严重影响我国东北地区榆树的正常生长，给经济和生态造成了巨大损失。榆紫叶甲，属鞘翅目叶甲科，是危害榆树的单食性害虫，国内分布于黑龙江、吉林、辽宁、河北、贵州等省和内蒙古自治区，国外分布在俄罗斯西伯利亚。榆紫叶甲繁殖能力强，因缺少有效防治手段，连年危害，早春专食榆树叶芽，致其不能长出叶片，造成树势衰弱，生长缓慢，成为“小老树”或“干枝梅”。营林措施，物理防治，化学防治，生物防治，这4种方法是目前防治榆紫叶甲的主要防治方法。但存在效率低下、费事费力、适用范围较窄、污染环境、成本过高等缺点。以上提到的四种方法均不能安全有效的控制榆紫叶甲对榆树的破坏，因此探究新的防治方法显得尤为重要。空气当中，存在着极为丰富的信息分子，这些信息分子对昆虫的一系列行为活动具有重要的调控作用，例如交配、产卵、觅食、寻找寄主。昆虫同样也进化成了高度专一和极其敏感的嗅觉系统来识别这些信息分子。昆虫的嗅觉感受过程是把化学信号转化为电信号的过程，而完成这一过程需要大量的外周嗅觉蛋白的参与才能完成，而大多情况下是在气味结合蛋白的参与下完成的。研究发现AquaOBP4与榆紫叶甲体内的其他气味结合蛋白相比，具有很高的触角特异性，在榆紫叶甲触角中的表达量最高。为了充分利用AquaOBP4的这一功能和选择性，我们通过表达和纯化这种蛋白质，并对与之相关的活性气味进行筛选，通过对AquaOBP4的序列进行同源模版筛选，建立一个可靠的分子筛选模型，利用所获得的数据，更好地了解OBP结构与活性气味之间的相互作用，获得了结合能力较强的几种配体。然后再进行触角电生理反应和行为学验证来确定最佳诱剂。将这一最佳配体化合物作为诱捕器的诱芯，利用AquaOBP4与之的强结合能力，对今后防治榆紫叶甲提供了新的可行的方法。与以往利用昆虫对特定波长的光波、颜色、化学物质、声波等具有强烈趋向性的原理，研制出的黑光灯、诱虫色板、性诱剂诱捕器等用来捕杀或捕捉昆虫设备相比，我们的诱捕器是与昆虫的觅食相关的，是一种基于AquaOBP4的绿色植物源榆紫叶甲野外诱捕器。
技术实现思路
(一)要解决的技术问题本专利技术的目的，是根据在榆紫叶甲触角上高表达的AquaOBP4能够高效的识别、结合信号分子，通过建立一个可靠的AquaOBP4空间构象模型，来确定结合能力最强的配体，利用能与AquaOBP4较强结合的化合分子作为诱捕器的诱芯，来高效的防治榆紫叶甲。该方法与之前四种方法相比，具有防治效果明显，对劳动力要求少，耗时少，防治成本较低，受环境影响小的优点，是目前为止防治榆紫叶甲最成熟的方法。(二)技术方案为达到上述目的，我们以最佳化合物作为榆紫叶甲野外诱捕器的诱芯，来防治榆紫叶甲虫害。诱捕器包括防雨盖、透明挡板、诱剂存放罐、集虫装置。防雨盖是为了防治灰尘和雨水进入诱剂存放罐中，影响诱剂的正常挥发和浓度；透明挡板将空间分为几个部分，可以干扰昆虫的视线，在昆虫飞扑过来后，撞晕并掉落在集虫装置中；诱剂存放罐中存放有能与AquaOBP4高效结合的配体化合物，引诱昆虫飞扑过来；集虫装置中装有酒精、洗衣粉、洗洁精或油等，落入水中的榆紫叶甲，既因后翅受水中溶剂的干扰而不能从水中爬出，又因水瓶壁太光滑而不能通过瓶壁逃走，最终因能量消耗怠尽而溺死在水中。而本专利技术最关键的步骤是确定诱芯中配体化合物的成分，充分利用其能与AquaOBP4高效结合的特点，来对榆紫叶甲进行有效的防治。化合物的成分我们可以通过以下步骤实现:1.诱芯化合物成分确定(1)基于AquaOBP4的绿色功能化合物筛选自然界昆虫的一系列行为活动受空气中的信号分子调控的，而为了识别这些信号分子，昆虫的嗅觉进化的越来越灵敏。识别信号分子这一过程，主要是在气味结合蛋白的参与下完成的。在所有的气味结合蛋白中，AquaOBP4表现的最为敏感和活跃，同时AquaOBP4在榆紫叶甲的触角中表达量相当高，并具有极高的特异性。因此，我们把AquaOBP4作为本次研究对象。通过表达载体构建，蛋白表达与纯化过程成功获得了无His标签的AquaOBP4纯蛋白。(2)初步确定能与AquaOBP4较强结合的配体化合物我们根据AquaOBP4能与配体较强结合的原理，对现有昆虫野外诱捕器的诱芯部分进行改良设计而实现对榆紫叶甲较好的防治。因此，首先要确定最佳配体的身份。我们选择了40种候选配体化合物进行荧光竞争结合实验，其中与榆紫叶甲生境相关的39种化合物和最新发现的对榆紫叶甲具有趋避作用的Cinnamaldehyde作为荧光竞争结合的配体，结果如图1所述，根据所获得的结果使用GraphPadPrism软件进行绘制如图3所示，我们可以发现AquaOBP4与其中的五种化合物有较高水平的结合。(3)建模和功能化合物筛选对AquaOBP4的序列(去除信号肽)进行同源模版筛选。得到AquaOBP4与DmelOBPLUSH同源性最高，在On-lineSwiss-modelsoftware上进行AquaOBP4的模型构建。在进行分子对接之前，将有结合能力的5个化合物的分子结构用Sketchmode进行构造。经过分子对接发现，AquaOBP4具有两个结合位点如图4所示。其中Site1位于结合域的中心，处于螺旋α1,α2和α3中间，特别是被细长的疏水基团α3所环绕。Site2则位于Site1的左侧与后侧螺旋α4和α5所相近。(4)AquaOBP4的蛋白空间结构模型和功能化合物进行分子对接为了探究构建的蛋白空间构象模型是否可靠，作者在候选榆树和成虫粪便挥发物中根据有结合的5种配体的化学结构，选取了两个类似物(Butyloctylphthalate,Isoeugenol)有可能与AquaOBP4结合的气味配体，进行分子对接。我们将以上7种化合物与AquaOBP4的结合能力做了一个分数评估，结果如图2所示。(5)功能化合物EAG和行为学检验为了进一步测试与AquaOBP4相结合的三种最佳配体的生物功能，我们对其进行了EAG和y-试管的检测。Dibutylphthalate,Diisobutylphthalate和Butyloctylphthalate都引起了强烈的触角电生理反应(如图6)。然而，当对这三种配体进行不同浓度的测试时，检测到的触角电生理反应没有明显的变化(图5)。y-试管嗅觉测量仪的结果显示(如图7)，这三种被检测的气味都能吸引榆紫叶甲的成虫(1μg/μl)。在有气味的一侧，昆虫的数量要远远大于控制侧的数量(p<0.01)。此外，在三种检测的气体中没有发现明显的差异，而Dibutylphthalate对榆紫叶甲的吸引力稍高一些。因此，我们以Dibutylphthalate为诱捕器的诱芯。2.基于上述最佳配体化合物为诱芯，制作诱捕器(1)防雨盖的制作防雨盖是一个铁皮圆锥体，是为了防治灰尘和雨水进入诱剂存放罐中，影响诱剂的正常挥发和浓度。它的侧边和透明挡板的顶部固定在一起。(2)挡本文档来自技高网...

【技术保护点】
基于AquaOBP4的绿色植物源榆紫叶甲野外诱捕器设计，其特征系统是由防雨盖、多块透明挡板、集虫装置和诱剂存放罐组成。与以往利用昆虫对特定波长的光波、颜色、化学物质、声波等具有强烈趋向性的原理，研制出的黑光灯、诱虫色板、性诱剂诱捕器等用来捕杀或捕捉昆虫设备相比，我们的诱捕器是与昆虫的觅食相关的，是一种基于AquaOBP4的绿色植物源榆紫叶甲野外诱捕器。

【技术特征摘要】
1.基于AquaOBP4的绿色植物源榆紫叶甲野外诱捕器设计，其特征系统是由防雨盖、多块透明挡板、集虫装置和诱剂存放罐组成。与以往利用昆虫对特定波长的光波、颜色、化学物质、声波等具有强烈趋向性的原理，研制出的黑光灯、诱虫色板、性诱剂诱捕器等用来捕杀或捕捉昆虫设备相比，我们的诱捕器是与昆虫的觅食相关的，是一种基于AquaOBP4的绿色植物源榆紫叶甲野外诱捕器。2.基于AquaOBP4的绿色植物源榆紫叶甲野外诱捕器设计，其特征是由下述步骤实现:一、首先要确定参与信号分子调控，并且能与之结合的受体。自然界昆虫的一系列行为活动受空气中的信号分子调控的，而为了识别这些信号分子，昆虫的嗅觉进化的越来越灵敏。识别信号分子这一过程，主要是在气味结合蛋白的参与下完成的。在所有的气味结合蛋白中，AquaOBP4表现的最为敏感和活跃，同时AquaOBP4在榆紫叶甲的触角中表达量相当高，并具有极高的特异性。因此，我们把AquaOBP4作为本次研究对象。二、根据目标确定能与AquaOBP4强结合的配体化合物的种类。我们选择了40种配体进行荧光竞争结合实验，其中榆紫叶甲生境相关的39种化合物和最新发现对榆紫叶甲具有趋避作用的Cinnamalde...

【专利技术属性】
技术研发人员：王寅亮，刘雨林，任炳忠，
申请(专利权)人：东北师范大学，
类型：发明
国别省市：吉林,22