一种工业化大规模生产富含黄酮的天山雪莲培养物的方法技术

本发明专利技术涉及一种工业化大规模生产富含黄酮的天山雪莲培养物的方法，属于雪莲培育技术领域。其通过诱导天山雪莲愈伤组织、筛选天山雪莲培养物和大规模生产天山雪莲培养物。本发明专利技术使用灭过菌的天山雪莲种子培养无菌苗，以无菌苗诱导出天山雪莲愈伤组织，改变培养基、培养温度，筛选出增殖稳定、性状稳定、富含黄酮的天山雪莲培养物，并使用固体培养/液体悬浮培养和气升式培养大规模生产天山雪莲培养物。本发明专利技术可在保证黄酮含量的基础上，稳定高产天山雪莲培养物，并有生产周期短、生产品质统一、适应常温生长条件的优点。

A method for large-scale production of flavone rich Saussurea involucrata with flavonoids

The invention relates to a method for large-scale industrial production of flavanone rich Tianshan snow lotus culture, which belongs to the field of snow lotus cultivation technology. It can be used to induce the callus of Tianshan Saussurea involucrata, to screen the culture of Saussurea involucrata and to produce the culture of Saussurea involucrata on a large scale. The invention uses asetic Saussurea involucrata seed culture aseptic seedling and in vitro seedling induced callus of Saussurea involucrata, changing the culture medium, culture temperature, screened proliferation stability, stable performance, flavonoid rich culture of s.involucrata using solid culture / liquid suspension culture and elevating culture of mass production of Saussurea involucrata culture. The invention can stabilize the high yield Saussurea involucrata culture on the basis of guaranteeing the content of flavones, and has the advantages of short production cycle, uniform production quality and suitable growth conditions at room temperature.

【技术实现步骤摘要】
一种工业化大规模生产富含黄酮的天山雪莲培养物的方法
本专利技术涉及一种工业化大规模生产富含黄酮的天山雪莲培养物的方法，属于雪莲培育

技术介绍
天山雪莲含有黄酮、生物碱、多糖等多种有效成分，具有活血通经、散寒除湿、止血消肿、排体内毒素等功效。近年来，天山雪莲作为民族药和民间药在抗炎镇痛、抗早孕、抗衰老及抑制癌细胞增生方面的作用备受关注。天山雪莲生于海拔2400~4000米的高山雪线附近的岩缝、石壁和冰磺砾石滩中，自然条件下由于生长环境特殊，3至5年才能开花结果，花期时种子在山间随风飘散，只有遇到适宜环境的种子才有可能萌发和生长，故自然繁殖率较低。1996年中国已将天山雪莲列为二级保护植物，天山雪莲是唯一列入《中国植物红皮书》的雪莲植物，是中国国家三级濒危物种。2000年国务院13号文件已明令禁止采挖野生雪莲。由于天山雪莲严苛的生长条件和较低的繁殖率，加上人们长期的过度采挖，使天山雪莲资源严重不足。通过植物组培工程培育富含黄酮的天山雪莲培养物，一方面解决了天山雪莲资源不足的问题，另一方面提高了有效成分的含量。
技术实现思路
本专利技术的目的是克服天山雪莲培养物中黄酮含量低、品质不一的不足之处，提供一种工业化大规模生产富含黄酮的天山雪莲培养物的方法，可在保证黄酮含量的基础上，稳定高产天山雪莲培养物。本专利技术的技术方案，一种工业化大规模生产富含黄酮的天山雪莲培养物的方法，步骤如下：（1）使用天山雪莲种子经过灭菌处理后诱导无菌苗；（2）将无菌苗的叶、根和茎转接至MS添加植物激素的培养基上，诱导愈伤组织；（3）挑选出颜色最深、生长良好的愈伤组织，在筛选培养基上继代培养，获得紫色、增殖快、性状稳定的雪莲培养物A；（4）将雪莲培养物A置于10~12℃培育15~20d，在筛选培养基上多次继代，不断挑选颜色最紫、性状最好的雪莲培养物，每隔2个月温度提高3度培养，直至23~27℃，挑选获得雪莲培养物B；（5）将雪莲培养物B进行大规模的气升式培养，收集烘干即为富含黄酮的雪莲培养物。步骤（1）具体步骤为：用质量浓度为75%乙醇浸泡天山雪莲种子30~40s，然后无菌水洗涤2~3遍，再用质量浓度为0.1%的氯化汞溶液浸泡15~20min，无菌水清洗3~5遍，接种于MS固体培养基上，进行光照培养得到无菌苗，光照条件为2000~3000Lux，10~12h/d。步骤（2）具体步骤如下：将步骤（1）所得无菌苗的叶、根和茎接种于添加了0.5~2mg/L6-BA和0.5~2mg/LNAA的MS固体培养基上，避光培养。步骤（3）和步骤（4）所述的筛选培养基均为添加了0.5~2mg/L6-BA和0.5~2mg/LNAA的MS固体/液体培养基，光照条件为2000~3000Lux，10~12h/d。步骤（3）和步骤（4）所述继代培养包括固体培养和液体悬浮培养交叉培养。步骤（5）具体步骤为：将雪莲培养物B进行大规模的气升式培养，气升式培养基为MS液体培养基，光照条件为2000~3000Lux，12h/d，充气量为0.2L/min；然后收集培养物在50-70℃下烘干20-24h，即得到天山雪莲培养物。上述MS液体/固体培养基中根据配比加入蔗糖和/或琼脂。本专利技术的有益效果：本专利技术改变了培养基和培养温度，筛选出稳定增殖、性状稳定、富含黄酮的天山雪莲培养物，使用固体培养、液体悬浮培养和气升式培养大规模生产天山雪莲培养物。本专利技术可在保证黄酮含量的基础上，稳定高产天山雪莲培养物，并有生产周期短、生产品质统一、适应常温生长条件的优点。具体实施方式实施例1（1）使用天山雪莲种子经过灭菌处理后诱导无菌苗；灭菌步骤包括，用75%乙醇浸泡30s，无菌水洗涤2遍，0.1%氯化汞溶液浸泡15min，无菌水清洗3遍，接种于MS固体培养基上，光照2000Lux，12h/d。（2）将无菌苗（叶、根、茎）转接至MS添加植物激素的培养基上，诱导愈伤组织；诱导培养基为0.5mg/L6-BA+0.5mg/LNAA+MS+200g/蔗糖+5.6g/L琼脂，培养条件是光照2000Lux，12h/d。（3）挑选出颜色最深、接近紫红色，生长良好的愈伤组织，在筛选培养基上继代培养，获得紫色、增殖快、性状稳定的雪莲培养物A；筛选培养基为0.5mg/L6-BA+0.8mg/LNAA+MS+200g/蔗糖+5.6g/琼脂，培养条件是光照2000Lux，12h/d。（4）将雪莲培养物A置于10度培育20天，在筛选培养基上多次继代，不断挑选颜色最紫、性状最好的雪莲培养物，每隔2个月温度提高2度培养，直至27度，挑选获得雪莲培养物B。（5）将雪莲培养物B进行大规模的气升式培养，收集烘干即为富含黄酮的雪莲培养物。气升式培养基为MS+250g/L蔗糖，2000Lux，12h/d，充气量为0.2L/min。实施例2（1）使用天山雪莲种子经过灭菌处理后诱导无菌苗；灭菌步骤包括，用75%乙醇浸泡30s，无菌水洗涤3遍，0.1%氯化汞溶液浸泡15min，无菌水清洗5遍，接种于MS固体培养基上，光照3000Lux，10h/d。（2）将无菌苗（叶、根、茎）转接至MS添加植物激素的培养基上，诱导愈伤组织；诱导培养基为2.5mg/L6-BA+2.5mg/LNAA+MS+250g/L蔗糖+6g/L琼脂，培养条件是光照3000Lux，10h/d。（3）挑选出颜色最深、接近紫红色，生长良好的愈伤组织，在筛选培养基上继代培养，获得紫色、增殖快、性状稳定的雪莲培养物A；筛选培养基为2mg/L6-BA+2.5mg/LNAA+MS+250g/L蔗糖+6g/L琼脂，培养条件是光照3000Lux，10h/d。（4）将雪莲培养物A置于15度培育15天，在筛选培养基上多次继代，不断挑选颜色最紫、性状最好的雪莲培养物，每隔2个月温度提高3度培养，直至27度，挑选获得雪莲培养物B。（5）将雪莲培养物B进行大规模的气升式培养，收集烘干即为富含黄酮的雪莲培养物。气升式培养基为MS+250g/L蔗糖，3000Lux，10h/d，充气量为0.2L/min。实施例3（1）使用天山雪莲种子经过灭菌处理后诱导无菌苗；灭菌步骤包括，用75%乙醇浸泡30s，无菌水洗涤2遍，0.1%氯化汞溶液浸泡15min，无菌水清洗4遍，接种于MS固体培养基上，光照3000Lux，11h/d。（2）将无菌苗（叶、根、茎）转接至MS添加植物激素的培养基上，诱导愈伤组织；诱导培养基为1mg/L6-BA+2mg/LNAA+MS+250g/L蔗糖+5.8g/L琼脂，培养条件是光照2800Lux，11h/d。（3）挑选出颜色最深、接近紫红色，生长良好的愈伤组织，在筛选培养基上继代培养，获得紫色、增殖快、性状稳定的雪莲培养物A；筛选培养基为2mg/L6-BA+2mg/LNAA+MS+230g/L蔗糖+5.8g/L琼脂，培养条件是光照2500Lux，11h/d。（4）将雪莲培养物A置于13度培育18天，在筛选培养基上多次继代，不断挑选颜色最紫、性状最好的雪莲培养物，每隔2个月温度提高2度培养，直至26度，挑选获得雪莲培养物B。（5）将雪莲培养物B进行大规模的气升式培养，收集烘干即为富含黄酮的雪莲培养物。气升式培养基为MS+250g/L蔗糖，2800Lux，12h/d，充气量为0.2L/min。本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种工业化大规模生产富含黄酮的天山雪莲培养物的方法，其特征是步骤如下：（1）使用天山雪莲种子经过灭菌处理后诱导无菌苗；（2）将无菌苗的叶、根和茎转接至MS添加植物激素的培养基上，诱导愈伤组织；（3）挑选出颜色最深、生长良好的愈伤组织，在筛选培养基上继代培养，获得紫色、增殖快、性状稳定的雪莲培养物A；（4）将雪莲培养物A置于10~12℃培育15~20d，在筛选培养基上多次继代，不断挑选颜色最紫、性状最好的雪莲培养物，每隔2个月温度提高3度培养，直至23~27℃，挑选获得雪莲培养物B；（5）将雪莲培养物B进行大规模的气升式培养，收集烘干即为富含黄酮的雪莲培养物。

【技术特征摘要】
1.一种工业化大规模生产富含黄酮的天山雪莲培养物的方法，其特征是步骤如下：（1）使用天山雪莲种子经过灭菌处理后诱导无菌苗；（2）将无菌苗的叶、根和茎转接至MS添加植物激素的培养基上，诱导愈伤组织；（3）挑选出颜色最深、生长良好的愈伤组织，在筛选培养基上继代培养，获得紫色、增殖快、性状稳定的雪莲培养物A；（4）将雪莲培养物A置于10~12℃培育15~20d，在筛选培养基上多次继代，不断挑选颜色最紫、性状最好的雪莲培养物，每隔2个月温度提高3度培养，直至23~27℃，挑选获得雪莲培养物B；（5）将雪莲培养物B进行大规模的气升式培养，收集烘干即为富含黄酮的雪莲培养物。2.如权利要求1所述工业化大规模生产富含黄酮的天山雪莲培养物的方法，其特征是步骤（1）具体步骤为：用质量浓度为75%乙醇浸泡天山雪莲种子30~40s，然后无菌水洗涤2~3遍，再用质量浓度为0.1%的氯化汞溶液浸泡15~20min，无菌水清洗3~5遍，接种于MS固体培养基上，进行光照培养得到无菌苗，光照条件为2000~3000Lux，10~12h/d。3.如...

【专利技术属性】
技术研发人员：高蕴珺，
申请(专利权)人：江苏凤谷生物有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32