本发明专利技术公开了一种具有独立结构／功能蛋白片段的获得方法。该蛋白片段的获得方法，包括以下步骤：１）随机切割编码蛋白的多核苷酸序列，然后再进行重组，得到不同长度的多核苷酸随机片段；２）将步骤１）获得的多核苷酸随机片段连接入含有选择标记基因的表达载体中，再将所述重组表达载体导入宿主，培养宿主，得到具有独立结构／功能的蛋白片段。本发明专利技术不具有基因／蛋白的特异性，筛选方法简单易行，将在具有独立结构／功能的蛋白片段的筛选中发挥巨大作用。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及分子生物领域中。
技术介绍
普遍认为蛋白质的多肽骨架是由具有一定结构、功能的小片段组成的。序列和结构分析表明，这些小片段的集合能够折叠成相对独立的结构域(domain)(Doolittle，R.F.，The multiplicity of domains in proteins.Annu.Rev.Biochem.1995，64287-314；Thornton，J.M.，Orengo，C.A.，Todd，A.E.&Pearl，F.M.，Protein folds，functions and evolution.J.Mol.Biol.1999，293333-342；Apic，G.，Gough，J.&Teichmann，S.A.，Domain combinations in archaeal，eubacterialand eukaryotic proteomes.J.Mol.Biol.2001，310311-325.)。在某特定位点对蛋白质(酶)进行操作，如将其分为两部分、环状排列蛋白序列(circularpermutation)或者插入外源蛋白片段等，蛋白质(酶)依然能够保持活性，上述结果也表明蛋白质是小多肽的集合(Regan，L.，Protein redesign.Curr.Opin.Struct.Biol.1999，9494-499.)。这些研究引起了人们寻找这些特殊位点，即寻找具有一定结构、功能蛋白片段的关注，因为这对研究蛋白质的结构功能关系以及蛋白质的折叠机理等具有重要意义。在此基础上，甚至可以构建出自然界不存在的新的功能酶。对HIV等病毒的表面抗原蛋白的研究表明，一些抗原决定位点包裹于蛋白内部，从而逃脱了免疫细胞的攻击。因此找到这些决定位点并且暴露出来，将会极大地促进病毒疫苗的研究。由此可见获得能够独立表达的蛋白片段是非常必要和有意义的。目前，蛋白质切割的方法主要有蛋白质水解法、化学裂解法、以及利用蛋白质及基因工程的方法合成相应蛋白片断等方法，如对大肠杆菌(Escherichia.coli)的色氨酸合成酶的α亚基(tryptophan synthase αsubunitTSα)进行蛋白酶处理，获得两个结构域(1-188a.a和189-268a.a)(Higgins，W.，Fairwell，T.&Miles，E.W.，An active proteolytic derivative of the subunit of tryptophan synthase.Identification of the site of cleavage and characterization of the fragments.Biochemistry，1979，184827-4835.)。Hiraga K.等人利用色氨酸合成酶α亚基的N端和C端的功能互补以及通过色氨酸合成酶的酶活选择方法，获得该蛋白的结构功能单元(Hiraga，K.，Yamagishi，A.，and Oshima，T.，Mapping of unit boundariesof a proteinexhaustive search for permissive sites for duplication bycomplementation analysis of random fragment libraries of tryptophan synthaseαsubunit.J.Mol.Biol.2004，3351093-1104)。基于蛋白质的结构信息分析，设计相应的蛋白片断来研究其折叠性能的方法(Zitzewitz，J.A.，Gualfetti，P.J.，Perkons，I.A.，Wasta，S.A.&Matthews，C.R.，Identifying the structuralboundaries of independent folding domains in the alpha subunit of tryptophansynthase，a beta/alpha barrel protein.Protein Sci.，1999.8(6)1200-1209)，以及结合PDB蛋白数据库发展起来的结构模型预测方法(Fischer KF，Marqusee S.，A rapid test for identification of autonomous folding units in proteins.J.Mol.Biol.2000，302(3)701-712)等也有报道。但这些现有的研究方法需要对蛋白质的结构或者功能具有比较清楚的了解(蛋白结构被解析或者确定的酶活检测方法)，且利用蛋白酶水解法或化学裂解法只能对特殊位点进行操作，因而能够获得的数据非常有限。由于人们对蛋白质结构和功能间的关系了解有限，另外由于现有方法的筛选库比较小、且操作复杂、耗时费力，因此现有方法都存在一定的局限性，很难广泛应用并且达到快速筛选具有独立结构/功能的蛋白片段的目的。在宿主细胞(尤其是大肠杆菌)内，蛋白质大量表达经常会引起蛋白质的错误折叠甚至聚集沉淀。尽管在蛋白质体外复性方面已经进行了大量的研究工作，但目前还没有行之有效的方法。Geoffrey等人(Geoffrey S.W.，Blake M.S.，Joel B.，ThomasC.T.，Rapid protein-folding assay using green fluorescent protein，NatureBiotechnology，1999，17691-695)构建了含有蛋白质正确折叠报告蛋白的载体，即在GFP基因的N-端通过linker与测试蛋白相连。通过测试20种外源蛋白表明，大肠杆菌的荧光表达与GFP基因上游的外源蛋白区域能够独立、大量的表达相互依赖。该方法具有检测方便，不需要对目的蛋白进行结构分析即能有效的判断外源蛋白的功能表达特性的特点，但是由于该方法是基于筛选(Screening)来获得目的片断的，存在工作量大，费时费力的缺点；同时GFP是比较大的蛋白(28kD)，对于融合蛋白的大小存在一定的限制。Maxwell等人以提高蛋白的可溶性构建了一个含有氯霉素乙酰转移酶(chloramphenicol acetyl transferase，CAT)的载体(Maxwell，K.，et al.，A simplein vivo assay for increased protein solubility.Protein Science，1999.8(9)1908-1911.)，而F.H.Arnold等用CAT来进行预筛选以方便的获得的含有杂交蛋白的变种(Sieber，V.，C.Martinez，and F.Arnold，Libraries of hybrid proteins fromdistantly related sequences.Nature Biotechnology，2001，19(5)456-460.)。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供。本专利技术所提供的获得具有独立结构/功能蛋白片段的方法，包括以下步本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种获得具有独立结构／功能的蛋白片段的方法，包括以下步骤： １）切割编码蛋白的多核苷酸序列，然后再进行重组，得到不同长度的多核苷酸随机片段； ２）将步骤１）获得的多核苷酸随机片段连接入含有编码具有选择功能的报告蛋白基因的载体中，再将所述重组载体导入宿主，培养宿主，得到具有独立结构／功能的蛋白片段。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：林章凛，陈勇，李爽，
申请(专利权)人：清华大学，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]
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