阻止和治疗细胞死亡的手段以及它们的生物学应用制造技术

阻止、遮掩／沉默细胞死亡中半胱天冬酶－２活性的抑制剂。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及阻断、阻止或治疗细胞死亡尤其是神经细胞死亡的手段、方法和产品。为了去除多余的神经元，在胚胎发生过程中发生神经元细胞死亡以确保合适的突出前或突出后连接，并允许功能性成人大脑的形成。除了与正常衰老相关的有丝分裂后死亡外，急性损伤(例如，缺氧-缺血、中风、脊髓损伤、创伤)或慢性神经退行性疾病过程中，环境或基因突变因子可以诱导成人的神经元死亡。与这些紊乱相关联的细胞死亡可以通过三个截然不同的机制发生，展现了坏死、自噬或凋亡的形态学和生物化学特性。生理和病理的神经元死亡通常都与有缺陷的凋亡调节相关联，哺乳动物细胞内导致这个有活性的细胞自杀机制的信号传导途径可以分为半胱氨酰天冬氨酸特异性蛋白酶(半胱天冬酶(caspase))依赖性和半胱天冬酶非依赖性途径。神经元凋亡是有活性的细胞自杀机制，可分为顺序的阶段，包括启动、判断、执行和降解。特异性机器的激活，包括半胱氨酸依赖性天冬氨酸特异性蛋白酶(半胱天冬酶)和可以起决定性(或扩大)调节性细胞器作用的线粒体，都驱使了这个级联事件。的确，线粒体的改变包括线粒体内膜电化学梯度(Δψm)的丢失和例如细胞色素C、Smac/Diablo和凋亡诱导因子的促凋亡因子的释放。一旦从线粒体释放，这些效应子触发半胱天冬酶依赖性和/或半胱天冬酶非依赖性细胞浆和细胞核的分解。因此，线粒体因子联合半胱天冬酶造成了凋亡的降解相，导致细胞皱缩、核凝聚(condensation)、凋亡小体的发射和例如磷脂酰丝氨酸转位到浆膜外叶的“吃我”信号的出现。在没有噬菌细胞存在下，进行凋亡的细胞最后发生非特异性浆膜破裂，称为继发坏死。神经元凋亡过程中线粒体、半胱天冬酶和其它事件各自的作用仍然没有阐明，特别是关于给定的死亡诱导剂/细胞类型偶联。直到最近，主要通过两个类型的手段研究了神经元细胞的凋亡和坏死第一组(生化)技术一般用线粒体琥珀酸脱氢酶活性(MTT试验)或乳酸脱氢酶活性细胞外释放(LDH试验)的比色法评价神经元死亡的晚期事件。这些常规的单参数定量技术没有给予关于细胞死亡机制的信息，并且不能与其它生化过程的检测联合。近来，对于通过免疫印迹生化评估细胞色素C转位并使用产荧光的底物评估半胱天冬酶的激活发表了一些适合神经元细胞分级分离方案。这些最近的方法给予了神经元群的半定量信息，但是排除了多参数和实时分析。第二组技术使用荧光显微镜(FM)读出装置检测了细胞器的修饰或凋亡相关蛋白质。这些FM研究大部分集中于后期细胞核的改变，包括染色体形态的显现(Hoechst染色)和/或DNA片段化的生化检测(TUNEL试验)。在一些最近的神经元FM研究中，报告了(固定细胞中)细胞色素C的免疫定位，但是与细胞生物学其它领域相反，有限数量的神经元研究使用了线粒体改变和半胱天冬酶激活的原位检测。当应用于培养的原代神经元时，基于FM的分析很耗时、费工，并且细胞体聚集物和重叠的轴突网络阻碍了定量分析。另外，敏感荧光探针的光学淬灭能够导致显著的错误解释，并且排除了早期死亡相关事件的实时追踪。因而，在原代神经元中关键凋亡事件的细胞生物学特点还没有完全证明和排序。本专利技术者开发了分析凋亡现象动力学的互补和定量的途径，特别是对于原代皮层神经元或神经元细胞系或非神经元细胞系有用。这样的途径使得本专利技术者开发了组织和分析与凋亡相联系的分子事件的新方法。为了用这个方法评价神经元细胞中凋亡相关事件的时间表和分级(hierarchy)，本专利技术者详尽说明了实验性急性死亡模型以测定干扰凋亡过程的更加邻近的可逆检查点并将所述方法应用于这个模型。有利地，能够在神经元细胞、神经元细胞系以及非神经元细胞和非神经元细胞系上进行这个评价。本专利技术的目的是提供多参数分析和成像平台方法，以鉴别阻止细胞死亡的细胞检查点，及其阻断和阻止细胞死亡的用途。本专利技术的另一个目的是专利技术者提供了实时跟踪神经元或细胞系中一个或多个凋亡印记的方法。本专利技术的另一个目的是提供诱导半胱天冬酶-2(也称为Nedd-2；Ich-1)的基因沉默或抑制前凋亡半胱天冬酶-2的活性(或干扰下游半胱天冬酶-2依赖性过程)的新型化合物。本专利技术的另一个目的是提供治疗涉及半胱天冬酶-2的疾病和损伤的药物组合物和方法。根据一个方面，本专利技术涉及阻止细胞死亡的方法，包含在给定的细胞类型中依赖于给定的诱导途径对凋亡相关事件的分级(hierarchy)的测定和更加邻近的可逆检查点的阻断以干扰凋亡过程。在神经元中通过联合快速定量流式细胞仪和定量/定性荧光显微镜分析很便利地进行这个方法。所述方法也能用在神经元细胞系上。这两个技术的使用实现了凋亡的判断、效应、早期和晚期降解阶段的共检测。如实施例所说明地，本专利技术提供了开发可靠地实时流式细胞仪的方法以监测应答于包括MPTP处理的神经毒性损伤的Δψm和浆膜、核和细胞形态颗粒度和细胞大小变化。使用特异性非重叠荧光探针和/或特异性抗体和/或药理试剂，本专利技术提供了实现研究凋亡的细胞生物学并特征分析新的保护性分子的有用的手段(mean)。本专利技术者使用了神经元培养中血清的剥夺作为实验模型以研究神经元死亡的途径以及鉴别上游检查点。神经元发育和病理过程中，不能找到合适靶点或代谢物(氧气、葡萄糖、钾、神经营养或生长因子、养分)和靶点衍生神经营养因子来源的神经元发生凋亡性细胞死亡(Deckwerth等人，1996；Deshmuck等人，1996和1998；Lipton，1999；Plenisla等人，2001；Chang等人，2002)。在急性血清剥夺(SD)诱导的神经元细胞死亡的上下文中，通过使用所述多参数和成像分析平台并且通过研究半胱天冬酶的选择性作用(药理抑制；小干扰RNA基因压制(knock-down))，本专利技术者发现半胱天冬酶-2是Bax依赖性MMP的上游调节子。相应地，本专利技术特别涉及检查点是半胱天冬酶-2的方法。如说明书和权利要求中使用的术语“半胱天冬酶”包含了替代剪切得到的各种形式。如本专利技术者所显示地，早期半胱天冬酶-2的激活是线粒体Bax转位、线粒体膜电位(Δψm)破坏、半胱天冬酶-9/半胱天冬酶-3细胞色素C释放依赖性的激活、核改变、磷脂酰丝氨酸暴露和浆膜的最终通透(PMP)所必需的。根据本专利技术的另一个实施方案，所述检查点是半胱天冬酶。根据另一个实施方案，所述检查点是不相关的半胱天冬酶的激活。本专利技术因而也涉及能够阻止或阻断半胱天冬酶-2活性(和/或半胱天冬酶-2/bax相互作用)以沉默半胱天冬酶-2表达的分子，以及用于治疗有半胱天冬酶-2参与的疾病和损伤，特别是治疗(缺氧-)缺血损伤的药物组合物。根据另一个方面，本专利技术涉及半胱天冬酶-2抑制剂和抑制/沉默神经元细胞死亡中半胱天冬酶-2的方法。本专利技术优选的实施方案中，半胱天冬酶-2抑制剂是分离的双链RNA分子，能够特异性靶向半胱天冬酶-2mRNA以降低或抑制半胱天冬酶-2的表达。本专利技术特别涉及尤其是小鼠和人来源的原代神经元或神经元细胞系中半胱天冬酶-2活性的降低或抑制。它也涉及对所述抑制剂对包括肿瘤细胞的非神经元细胞中半胱天冬酶-2的活性的降低或抑制。用于沉默半胱天冬酶-2的双链RNA分子是由15-25个核苷酸，优选地19-25个核苷酸的互补链组成的双体。优选地，稳定小干扰链的末端以抗降解。对于半胱天冬酶-2的沉默有本文档来自技高网...

【技术保护点】
阻止、遮掩／沉默细胞死亡中半胱天冬酶－２活性的抑制剂。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：D肖维尔，A博尔涅，E雅科托特，A朗戈恩，H勒克尔，D勒布莱特，
申请(专利权)人：萨拉普托斯股份公司，
类型：发明
国别省市：FR[法国]