因子VII或VIIa的GLA结构域变体制造技术

人因子Ⅶ或人因子Ⅶａ的Ｇｌａ结构域变体，包括相对于人因子Ⅶ或人因子Ⅶａ的１－１５个氨基酸的修饰，其中通过位置３４中的取代导入疏水氨基酸残基，或具有位置３６中的氨基酸取代，或具有位置１０和３２中的氨基酸取，以及选自位置７４、７７或１１６中的至少一种其它氨基酸取代。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及凝血因子VII(FVII)或凝血因子VIIa(FVIIa)多肽的新的Gla结构域变体，及所述多肽变体在治疗中的用途，具体是治疗多种凝血相关疾病的用途。
技术介绍
凝血是由多种血液组分(或因子)之间复杂的相互作用组成的过程，最终导致纤维蛋白凝块形成。通常参与被称为凝血“级联反应”的血液组分是原酶或酶原，即，不具有酶活性的蛋白，通过活化剂的作用其可转变为活性形式。FVII就是这些凝血因子中的一种。FVII是一种维生素K依赖性血浆蛋白，在肝中合成，并以分子量为53kDa的单链糖蛋白形式分泌到血液中(Broze & Majerus，J.Biol.Chem 1980；2551242-1247)。FVII酶原在单一位点R152-I153处被蛋白酶水解，产生由一个二硫键连接的双链，从而转变为活性形式(FVIIa)。FVIIa与组织因子的复合体(FVIIa复合体)可将凝血因子IX和凝血因子X均转变为其活性形式，接下来的反应导致快速的凝血酶产生以及纤维蛋白形成(Osterud & Rapaport，Proc Natl Acad Sci USA 1977；745260-5264)。FVII经历翻译后修饰，包括依赖维生素K的羧基化，导致在该分子N末端区产生10个γ羧基谷氨酸残基。因此，SEQ ID NO1中第6，7，14，16，19，20，25，26，29和35位残基是Gla结构域中对于FVII活性重要的γ羧基谷氨酸残基。其他翻译后修饰包括在第145和322位的两个天然产生的N-糖基化位点，以及在第52和60位的两个天然产生的O-糖基化位点处分别连接糖组分。编码人FVII(hFVII)的基因被定位于13号染色体的q34-qter9(deGrouchy等，Hum Genet 1984；66230-233)。其包含9个外显子，长度为12.8Kb(O′Hara等，Proc Natl Acad Sci USA 1987；845158-5162)。FVII的基因组构和蛋白结构与其它维生素K依赖性原凝血蛋白的结构相似，外显子1a和1b编码信号序列；外显子2编码多肽和Gla结构域；外显子3编码一段短的疏水区；外显子4和5编码表皮生长因子样结构域；以及外显子6到8编码丝氨酸蛋白酶的催化结构域(Yoshitake等，Biochemistry 1985；243736-3750)。利用X射线晶体成像的方法(Banner等，Nature，1996；38041和Zhang等，J.Mol.Biol，1999；2852089)，已报道了hFVIIa(Pike等，PNAS.U.S.A.，1999；968925-30和Kemball-Cook等，J.Struct.Biol，1999；127-213-223)，hFVIIa与可溶性组织因子的复合体，以及hFVII的小片段的实验三维结构(Muranyi等，Biochemistry，1998；3710605和Kao等，Biochemistry，1999；387097)。关于FVII蛋白工程化突变体的报道相对较少(Dickinson & Ruf，J BioChem，1997；27219875-19879，Kemball-Cook等，J Biol Chem，1998；2738516-8521，Bharadwaj等，J Biol Chem，1996；27130685-30691，Ruf等，Biochemsitry，1999；381957-1966)。已报道了FVII在BHK或其他哺乳动物细胞中的表达(WO92/15686，WO91/11514，WO88/10295)，以及FVII和kex2内切蛋白酶在真核细胞中的共表达(WO00/28065)。人重组FVIIa的商品化制剂以NovoSeven的名称出售。NovoSeven指明用于治疗血友病A或B患者的出血发作。NovoSeven是市售的可治疗出血发作的唯一有效并且可靠的rFVIIa。WO91/1154中报道了FVII的一种无活性形式，其中152的精氨酸和/或153的异亮氨酸被修饰。这些氨基酸位于活化位点。WO96/12800描述了一种丝氨酸蛋白酶抑制剂导致的FVIIa的失活；Petersen等说明了FVIIa在I153的α氨基酸基团氨甲酰化导致的失活(Eur J Biochem，1999；261124-129)。这种失活形式可以与野生型FVII或FVIIa竞争对组织因子的结合以及抑制凝固活性(clotting activity)。这提示这种FVIIa的失活形式可用于治疗极易产生凝血的患者，如患脓毒病的患者，其易于发作心肌梗塞或血栓性中风。对于治疗失控的出血诸如外伤等的情况，相信FVIIa能够活化FX为FXa而不与组织因子结合，并且所述活化反应据信主要见于活化的血小板(Hedner et al.Blood Coagulation & Fibrinolysis，2000；11；107-111)。然而，hFVIIa或rhFVIIa在缺乏组织因子的情况下对FX具有低活性，由此失控出血的治疗例如在外伤患者中，需要分别为高剂量和多个剂量的hFVIIa或rhFVIIa。因此，为更有效治疗失控出血(最小化失血)，需要改进的FVIIa分子，其在缺乏组织因子的条件下对FX具有高活性。所述改进的FVIIa分子与rhFVIIa相比，在用于失控的失血时，显示较低的凝血事件(作用较快/增加的凝固活性)。FVII/FVIIa的Gla结构域变体公开于WO 99/20767，US 6,017,882和WO 00/66753，其中位于Gla结构域中的一些残基鉴定为对于磷脂膜结合而言是重要的，并由此对FX活化是重要的。具体地，发现残基10和32是关键的，且增加的磷脂膜结合亲和力，以及由此增强的FX活化，可通过进行突变P10Q和K32E实现。具体地，发现FX活化与rhFVIIa相比在边缘凝血条件诸如在存在低水平组织因子的条件下增强。WO 01/58935公开通过定点糖基化或PEG化开发具有增加的半寿期等的FVII或FVIIa分子的新策略。WO 03/093465公开FVII或FVIIa变体，其具有位于Gla结构域中的修饰并具有导入Gla结构域外的一或多种N-糖基化位点。WO 2004/029091公开FVII或FVIIa变体，其具有位于组织因子结合位点的特定修饰。本专利技术人现在鉴定了Gla结构域中其它残基，其可进一步增加磷脂膜结合亲和力并由此进一步增强FX活化。本专利技术的FVII或FVIIa变体还降低组织因子结合亲和力。本专利技术的目标是提供改进的FVII或FVIIa分子(FVII或FVIIa变体)，其能够比hFVIIa，rhFVIIa或rhFVIIa更为有效地活化FX为FXa。具体地，本专利技术的目标是提供改进的FVII或FVIIa分子(FVII或FVIIa变体)，其能够在组织因子缺乏的条件下比hFVIIa，rhFVIIa或rhFVIIa更为有效地活化FX为FXa。这些目标通过本专利技术提供的FVII或FVIIa变体说明。
技术实现思路
本专利技术第一方面涉及因子VII(FVII)或因子VIIa(FVIIa)多肽变体，其具有这样的氨基本文档来自技高网...

【技术保护点】
因子Ⅶ（ＦⅦ）或因子Ⅶａ（ＦⅦａ）多肽变体，其具有这样的氨基酸序列，所述氨基酸序列包括相对于具有ＳＥＱ　　ＩＤ　　ＮＯ：１所示氨基酸序列的人因子Ⅶ（ｈＦⅦ）或人因子Ⅶａ（ｈＦⅦａ）的１－１５个氨基酸的修饰，所述变体包含选自下组的至少一种修饰：（ａ）通过位置３４中的取代导入疏水氨基酸残基，或（ｂ）位置３６中的氨基酸取代。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：杰斯珀M哈宁，金V安德森，克劳斯博尼斯，
申请(专利权)人：马克西根控股公司，
类型：发明
国别省市：KY[开曼群岛]