肿瘤抗原特异性T淋巴细胞的体外扩增方法技术

本发明专利技术涉及细胞毒性Ｔ淋巴细胞及其在抗肿瘤免疫反应中的应用。具体地说，本发明专利技术涉及联合使用白介素２、白介素１５和激发型抗ＣＤ２８单克隆抗体以及肿瘤抗原负载的抗原递呈细胞，诱导Ｔ细胞变为细胞毒性Ｔ淋巴细胞的方法。本发明专利技术进一步涉及按照所说的方法制备的细胞毒性Ｔ淋巴细胞在抗肿瘤免疫反应中的应用。

【技术实现步骤摘要】
专利技术的领域本专利技术涉及细胞毒性T淋巴细胞及其在抗肿瘤免疫反应中的应用。具体地说，本专利技术涉及联合使用白介素2、白介素15和激发型抗CD28单克隆抗体以及肿瘤抗原负载的抗原递呈细胞以诱导T细胞变为细胞毒性T淋巴细胞的方法。本专利技术进一步涉及按照所说的方法制备的细胞毒性T淋巴细胞在抗肿瘤免疫反应中的应用。专利技术的背景在机体抗肿瘤免疫应答过程中，细胞免疫处于中心地位。体内肿瘤特异性的细胞免疫功能的低下是肿瘤逃避免疫系统的监视无限制生长的重要原因之一。如何在体外获得足够量可供临床应用的肿瘤抗原特异性的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)是肿瘤过继免疫疗法中首先要面临的问题。T细胞特别是CD8+和CD4+T细胞在介导抗肿瘤免疫应答中起到不可替代的作用。T细胞的激活和扩增需要一系列免疫细胞和细胞因子的参与。树突状细胞(DC)作为功能最强大的抗原递呈细胞(APC)，将摄取、加工和处理后的抗原递呈给T细胞，赋予T细胞活化的第一信号。同时，DC表面的CD80/CD86(B7-1/B7-2)、CD40等共刺激分子与T细胞表面相应的受体或配体相互作用后，介导T细胞活化的第二信号。此外，CTL的活化还需要CD4+T细胞分泌的IL-2和IFN-γ等细胞因子的参与。对于肿瘤病人特别是中晚期肿瘤病人而言，由于机体内肿瘤负荷较大而且肿瘤细胞增殖迅速，所以在进行自体免疫治疗时要求能在体外扩增大量的自体抗原特异性CTL，然后回输患者体内以达到抑制或杀灭肿瘤细胞的目的。研究表明，虽然IL-2、IL-7、IL-15和IFN-γ等细胞因子以及激发型抗CD28和CD3单克隆抗体均可用于体外扩增CTL。然而，现有扩增方法的效率仍有待进一步提高，特别是单纯使用这些细胞因子扩增时常常会导致被激活的T细胞的凋亡(AICD)，因而本领域希望建立一种能够避免AICD发生的并且能够以更高的效率体外扩增CTL的方法。专利技术的目的本专利技术的目的是提供一种体外扩增细胞毒性T淋巴细胞的方法，该方法包括(1)由肿瘤病人外周血中分离得到贴壁生长的单核细胞；(2)在适当浓度粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子和白介素-4的存在下，培养步骤(1)得到的单核细胞，以诱导形成未成熟的树突状细胞；(3)于激发型抗CD40单克隆抗体存在下，将步骤(2)得到的未成熟的树突状细胞与肿瘤细胞共育，使所说的未成熟的树突状细胞变为特异性肿瘤抗原负载的成熟的树突状细胞；(4)用步骤(3)得到的抗原递呈细胞与白介素-2、白介素-15和激发型抗CD28单克隆抗体的混合物处理预先分离的T细胞，以促进所说的T细胞的扩增；(5)分离步骤(4)扩增得到的细胞毒性T淋巴细胞。根据本专利技术的优选实施方案，其中所说的肿瘤细胞是经处理后凋亡的病人自体肿瘤组织细胞。根据本专利技术的优选实施方案，其中所说的肿瘤细胞包括血液系统肿瘤和实体瘤细胞。根据本专利技术的优选实施方案，其中所说的细胞毒性T淋巴细胞是肿瘤抗原特异性的。本专利技术的另一个目的是提供如上得到的细胞毒性T淋巴细胞在肿瘤的过继性免疫治疗中的应用。附图简要说明附图说明图1显示不同的生物因子组合诱导的T细胞在不同时间点的表型改变。其中F为RPMI-1640空白对照组；A为IL-2+IL-15+CD28组；B为IL-7+IL-2组；C为IL-15+IL-2组；D为CD28+IL-2组；E为单独的IL-2组。横坐标给出三个不同的检测时间点1为DC激发前；2为DC激发后7天；3为DC激发后14天。纵坐标给出流式细胞仪(FCM)检测的细胞上各表型的百分表达率。图2显示不同的生物因子组合对T细胞增殖数目的影响。其中F组为RPMI-1640空白对照组；A为IL-2+IL-15+CD28组；B为IL-7+IL-2组；C为IL-15+IL-2组；D为CD28+IL-2组；E为单独使用IL-2组。横坐标为诱导后的天数；纵坐标为细胞数(单位106/ml)。图3显示不同的生物因子组合对自体T细胞增殖的影响。其中F组为RPMI-1640空白对照组；A为IL-2+IL-15+CD28组；B为IL-7+IL-2组；C为IL-15+IL-2组；D为CD28+IL-2组；E为单独使用IL-2组。纵坐标为刺激指数(SI)。图4显示不同的生物因子组合对扩增的CTL的细胞毒活性的影响。其中F组为RPMI-1640空白对照组；A为IL-2+IL-15+CD28组；B为IL-7+IL-2组；C为IL-15+IL-2组；D为CD28+IL-2组；E为单独使用IL-2组。Raji为B淋巴瘤细胞株；XG-2为多发性骨髓瘤细胞株；K562为杀伤细胞(NK)敏感株。图5显示不同生物因子组合激发的T细胞上清中IFN-γ的浓度变化。其中F组为RPMI-1640空白对照组；A为IL-2+IL-15+CD28组；B为IL-7+IL-2组；C为IL-15+IL-2组；D为CD28+IL-2组；E为单独的IL-2组。专利技术的具体内容本专利技术涉及细胞毒性T淋巴细胞及其在抗肿瘤免疫应答中的应用。具体地说，本专利技术涉及联合使用白介素2、白介素15和激发型抗CD28单克隆抗体以及肿瘤抗原负载的抗原递呈细胞，诱导T细胞扩增为细胞毒性T淋巴细胞的方法。本专利技术进一步涉及按该方法制备的细胞毒性T淋巴细胞在过继性抗肿瘤免疫中的应用。在人和哺乳动物的免疫系统中，T细胞介导迟发型超敏反应，移植物排斥和细胞毒活性等一系列细胞免疫反应。某些T细胞与专门的细胞表面蛋白质即MHC分子相互作用以在细胞表面上递呈抗原。专门化的抗原递呈细胞如巨嗜细胞和树突状细胞诱导细胞毒性和辅助T细胞增殖并识别靶细胞表面上表达的相应抗原。进而，T细胞(CTL)杀伤这些靶细胞，或者诱导其他细胞杀伤这些靶细胞。使用CTL进行肿瘤治疗中的关键技术之一是设法在体外获得大量的肿瘤抗原特异性CTL。传统的体外扩增CTL方法是采用大剂量的IL-2，这样虽然可以在短期内得到大量活化的T细胞，但很容易导致活化诱导的细胞死亡(AICD)，最终难以长时间稳定地获得足够量肿瘤特异性过继免疫治疗所需的细胞毒性T淋巴细胞。IL-2介导的效应可以分为两个阶段，早期低剂量的IL-2能够介导T细胞的增殖；但是在后期，随着活化T细胞数量的增多和IL-2浓度的逐渐升高，T细胞便很快地进入由Fas/FasL介导的活化诱导的细胞死亡(AICD)过程。因此，单纯使用IL-2并不能使T细胞在体外较长时间的扩增。作为一种非活化T细胞来源的细胞因子，IL-15主要由粘附性外周血单核细胞产生，并且结构上是由独特的α链以及与IL-2受体共享的β和γ(即γc)链组成的。IL-15可刺激活化的T细胞增殖，诱导CTL和淋巴因子激活的杀伤细胞(LAK)产生，促进B细胞分泌IgM、IgG、IgA。已有证据表明，IL-15在促进非抗原依赖性CD8+T细胞的分化和长期存活中起重要作用。IL-15与其受体的相互作用可导致CD8+T细胞的分化。T细胞活化过程中，IL-15和TCR两个途径在某些方面存在有共同点。因此，IL-15与IL-2具有相似的生物学效应，即两者都能促进T细胞的分化增殖。然而，与IL-2不同的是，IL-15与其受体结合后，能够稳定γc链，且上调抗凋亡基因bcl-2，从而表现有抗AICD和延长细胞的存活时间的作用。CD28可以提供T细胞活化所需的共刺激信号，促本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种体外扩增细胞毒性Ｔ淋巴细胞的方法，该方法包括：（１）由肿瘤病人外周血中分离得到贴壁生长的单个核细胞；（２）在适当浓度粒细胞－巨噬细胞集落刺激因子和白介素－４的存在下，培养步骤（１）得到的单核细胞，以诱导形成未成熟的抗原递 呈细胞；（３）于抗ＣＤ４０单克隆抗体存在下，将步骤（２）得到的未成熟的抗原递呈细胞与肿瘤细胞共育，使所说的未成熟抗原递呈细胞变为特异性肿瘤抗原负载的成熟的抗原递呈细胞；（４）用步骤（３）得到的抗原递呈细胞与白介素－２、白介素 －１５和激发型抗ＣＤ２８单克隆抗体的混合物处理预先分离的Ｔ细胞，以促进所说的Ｔ细胞的扩增；（５）分离步骤（４）扩增得到的细胞毒性Ｔ淋巴细胞。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：张学光，朱一蓓，席泓，
申请(专利权)人：苏州大学，
类型：发明
国别省市：32[中国|江苏]