本发明专利技术属生物制药领域，涉及抗肠出血性大肠杆菌（ＥＨＥＣ）Ｏ１５７志贺样毒素Ⅱ毒素亚单位Ｓｔｘ２Ａ单克隆抗体５Ｆ３重链和轻链可变区基因及其所述基因编码的多肽，以及所述基因和多肽在制备用于诊断和治疗ＥＨＥＣ Ｏ１５７感染及其并发症方面药物中的应用。本发明专利技术人采用通用的兼并性引物成功地从培养的一株抗Ｓｔｘ２Ａ特异性单克隆抗体５Ｆ３的杂交瘤细胞株中克隆了其对应抗体轻、重链可变区基因。基于上述的单克隆抗体５Ｆ３的轻、重链可变区基因，可以采用基因工程方法，构建和表达多种形式的小分子基因工程抗体，如ＳｃＦｖ抗体、嵌合抗体、抗体融合蛋白等，制备用于诊断和治疗ＥＨＥＣ Ｏ１５７感染及其并发症方面药物，将对诊断和治疗ＥＨＥＣＯ１５７感染及其并发症提供新的途径。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物制药领域，涉及抗肠出血性大肠杆菌(EHEC)O157志贺样毒素II毒素亚单位Stx2A单克隆抗体5F3重链和轻链可变区基因和多肽，以及所述基因和多肽在制备用于诊断和治疗EHEC O157感染及其并发症方面药物中的应用。
技术介绍
自EHEC O157于1982年被确认为致病菌以来，其引发的食物中毒在世界各地包括中国均发生了暴发流行。该菌的感染已经成为一个全球性的公共卫生问题，无论在发达国家还是发展中国家，都受到广泛关注。我国已将肠出血性大肠杆菌列为21世纪可能对国人卫生健康有重大影响的12种病原微生物之一。O157:H7感染可以引发严重并发症如溶血性尿毒综合征(Hemolyticuremicsyndrom，HUS)、血栓形成性血小板减少性紫癜(Thromboricthromobocytopenicporpura，TTP)，严重者可导致死亡，致死率可达5-10％。O157菌培养容易、繁殖迅速、感染力强、感染途径广泛，使之极有可能作为未来军事斗争中的细菌战剂和生物恐怖战剂。美国疾病控制中心(CDC)已将EHEC O157菌列为B类生物恐怖病原体严加防范。然而目前对其感染尚缺乏有效的治疗方法，临床上针对O157菌的感染主要采用抗生素治疗及相应的对症治疗。新近的研究发现，抗生素使菌体破裂，导致O157菌志贺毒素(Shiga toxin，ST)的释放水平大大提高，使得抗生素对病程无明显影响甚至导致病程的延长，从而可能增加发生并发症的危险并引起死亡。2002年国家卫生部制定的“肠出血性大肠杆菌O157:H7感染性腹泻应急处理预案(试行)”第5条病人的隔离治疗规定对肠出血性大肠杆菌O157:H7病人和疑似病人进行隔离治疗。病人的治疗以对症支持疗法为主，可以使用微生态制剂，原则上不用止泻药和抑制肠蠕动的药物。肠出血性大肠杆菌O157病人和疑似病人(包括粪便标本O157抗原胶体金方法检测阳性的腹泻病人)禁止使用抗生素，疫区内的其他一般腹泻病人应慎用抗生素。因此，无论从公共卫生还是生物反恐的需要出发，加强EHEC O157:H7的治疗研究已显得非常紧迫。EHEC O157可以产生两种毒素，分别称为志贺毒素I(Stx1)和志贺毒素II(Stx2)。在细菌体内，Stx2为分泌型表达，Stx1为胞内表达。两种毒素均由1个A亚单位和5个B亚单位组成，A亚单位具有细胞内毒性，能与28SrRNA作用导致蛋白质合成停止，是大肠杆菌O157:H7引起临床表现的病理基础；B亚单位具有细胞结合特性，能与具有特定受体(Gb3)的细胞结合，从而引导A亚单位发挥作用。多数O157:H7细菌产生Stx2，Stx2比Stx1与临床上重症并发症的关系更加密切，Stx2比Stx1的毒性大1000倍。Stx2可以进入血液循环，引起目标组织器官，如肾小球和胃肠道内皮细胞的损伤。因此Stx2是该菌致病性的重要物质基础。在HUS发生前，一般有3～5d的出血性结肠炎(HC)的前驱症状，发生HC后，在Stx结合到肾内皮细胞之前，有一段阻止Stx/Gb3结合的时间。研究证明使用能中和Stx2的特异性抗体可以预防HUS和血栓形成的血小板减少性紫癜等并发症的出现。因此实践中要求在未发生并发症之前对EHEC感染作出迅速诊断，及时使用抗体治疗。自1975年Kohler和Milstein创建B淋巴细胞杂交瘤技术以来，各种单克隆抗体相继出现，这些单克隆抗体不仅在疾病的基础研究方面发挥了积极的作用，同时也为多种疾病的诊治带来了新的希望。到目前为止，国内外尚无可用于治疗O157感染的抗体类药物，我们经过长期的大量的克隆筛选，获得了一株针对St×2A的高亲和性和高特异性的杂交瘤细胞株，其具有较高的应用价值和开发前景。
技术实现思路
本专利技术旨在提供抗志贺样毒素II(Shiga like toxin 2)毒素亚单位Stx2A单克隆抗体5F3的重链和轻链可变区基因极其编码的多肽，其重组后可表达出特异性识别和结合Stx2A的抗体活性片段。本专利技术的另一目的在于所述抗体5F3的基因或多肽在制备用于诊断和治疗EHEC O157感染及其并发症方面药物中的应用。根据本专利技术的一个方面，本专利技术涉及一种抗志贺样毒素II毒素亚单位Stx2A单克隆抗体5F3的重链和轻链可变区基因。本专利技术所述抗Stx2A单克隆抗体5F3的重链和轻链可变区基因是从能够稳定分泌高亲和性和高特异性的鼠源性抗Stx2A的单克隆抗体的杂交瘤细胞株5F3中克隆获得的。获得方式是从抗Stx2A的杂交瘤细胞株5F3中提取总RNA，以oligo(dT)15为随机引物，逆转录生成cDNA，然后采用通用的兼并性引物特异性分别扩增抗体轻、重链可变区基因，经过序列测定和在NCBI中BLAST比较分析后，确认5F3重链可变区核苷酸序列是序列表<400>1所示的核苷酸序列，其编码的氨基酸序列是序列表<400>3所示的氨基酸序列。轻链可变区基因基因序列是序列表<400>2所示的核苷酸序列，其编码的氨基酸序列是序列表<400>4所示的氨基酸序列。上述两个基因经重组后可表达出特异性识别和结合抗志贺样毒素II毒素亚单位Stx2A蛋白的抗体ScFv活性片段。对于本专利技术人成功克隆的抗Stx2A特异性单克隆抗体5F3轻、重链可变区基因，分别应用专业性的已知抗体基因序列数据库(IMGT)和(NCBI)对所得序列进行同源性比较和其胚系基因来源分析表明，所获得的基因序列的确来自小鼠胚系基因，和现有报道的各种抗体基因序列均不完全一致。所得VH与VL基因可编码正确的小鼠抗体可变区。根据本专利技术的另一个方面，本专利技术还涉及所述单克隆抗体5F3的基因及其编码的多肽在制备用于诊断和治疗EHEC O157感染及其并发症方面药物中的应用。本专利技术人采用通用的兼并性引物成功地从培养的一株抗Stx2A特异性单克隆抗体5F3的杂交瘤细胞株中克隆了其对应抗体轻、重链可变区基因。基于上述的单克隆抗体5F3的轻、重链可变区基因，可以采用基因工程方法，构建和表达多种形式的小分子基因工程抗体，如ScFv抗体、嵌合抗体、抗体融合蛋白等，制备用于诊断和治疗EHEC O157感染及其并发症方面药物，将对诊断和治疗EHEC O157感染及其并发症提供新的途径。附图说明图1为从抗Stx2A的杂交瘤细胞株5F3中提取总RNA的琼脂糖凝胶电泳图。图2为5F3中提取总RNA逆转录生成cDNA的琼脂糖凝胶电泳图。图3为PCR扩增的抗Stx2A单克隆抗体5F3轻、重链可变区基因的琼脂糖凝胶电泳图。图4为PCR扩增的抗Stx2A单克隆抗体5F3轻、重链可变区基因藉LinkerDNA连接后琼脂糖凝胶电泳图。图5为利用获得的5F3轻、重链可变区基因所构建的ScFv抗体表达载体的测序图谱。图6为Western blot检测ScFv抗体与抗原结合。具体实施方案1.鼠抗Stx2A单克隆抗体的制备2.抗Stx2A单克隆抗体5F3轻、重链可变区基因的克隆从抗Stx2A杂交瘤细胞株5F3中提取总RNA，以oligo(dT)15为随机引，RT-PCR逆转录生成cDNA，然后采用通用的兼并性引物特异性分别扩增抗体轻、重本文档来自技高网...
【技术保护点】
抗ＥＨＥＣＯ１５７志贺样毒素Ⅱ毒素亚单位Ｓｔｘ２Ａ单克隆抗体５Ｆ３的重链可变区基因和轻链可变区基因，其基因序列是序列表１和序列表３所示的核苷酸序列。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：邹全明，马颖，毛旭虎，杨珺，
申请(专利权)人：中国人民解放军第三军医大学，
类型：发明
国别省市：85[中国|重庆]
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