细胞对表面的附着制造技术

本发明专利技术涉及微载体，其表面经胍基固定有阳离子化合物。该微载体能够附着细胞，例如经电荷相互作用附着细胞，并有利于用作细胞培养的支持体。所述化合物可包含一个或两个氨基酸，如精氨酸或二肽。本发明专利技术还涉及制备聚阳离子微载体的方法，该方法包括将包含至少一个胍基的化合物固定在环氧化物活化的基质上。（*该技术在2024年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及在培养期间能够附着并维持细胞的微载体领域。更具体的说，本专利技术涉及的微载体由包被有增强细胞附着的化合物的多孔基质组成。本专利技术也包括制备这种微载体和进行细胞培养的方法。背景使用微载体支持体促进生物细胞生长已有长期且变更的历史。早期这种使细胞生长到可用数量的系统包括各种器皿和烧瓶。有意通过提高培养表面积而提高单位器具体积细胞生产量的努力导致了大盘子的使用。一些这种早期细胞生长系统仍然在小规模、大劳动量的细胞培养方法即足够的场所使用，例如在医院和大学中。但是，需要有其它方法用以大规模培养细胞。一种普遍的细胞培养方法是滚瓶系统。本质上，一个滚瓶就是一个装有小量营养培养基的圆筒状容器。操作中，滚瓶沿着其纵轴线缓慢旋转，使得营养培养基持续浸润瓶的整个内表面，而细胞就在这个表面上生长。可在滚瓶架上操作许多滚瓶。另一种普遍的方法是微载体系统。尽管近年来已经引入了其它技术例如膜系统，但微载体系统仍表现为最被广泛采用的方法，其中贴壁细胞的生长可以达到商业上有利的生产率。以这种方式进行的大规模培养优于通过复制如滚瓶系统和其它已知系统进行的大规模培养。另外，微载体生物反应器系统也适于贴壁细胞的大规模自动化培养。微载体的发展开始于20世纪六十年代末，当时证明在混悬培养模式下，葡聚糖珠可以作为贴壁细胞生长的基质。最早的微载体是基于利用普通的阳离子、强碱性、离子交换基团，例如二乙基氨基乙烷(DEAE)。自此以后，作为微载体已成功使用了许多不同的材料，包括玻璃、聚苯乙烯塑料、丙稀酰胺、固体胶原、多孔胶原、纤维素和液体碳氟化合物。通过共价键或非共价键将一个或多个黏着肽附着到表面的微载体也被建议使用。例如，美国专利号4,578,079(La Jolla ResearchFoundation)公开了一种示例性组合物，当其固定到基质上时将促进细胞的附着。这种公开的组合物是纤连蛋白的一个小片段，更具体的是包括连接到至少一个其他氨基酸上的Asp-Gly-Asp序列的多肽片段。因此，公开的四肽组合物具有与纤连蛋白基本相同的细胞附着活性，这种附着活性基于生物特异性亲和相互作用。这种组合物的明显缺点是其具有的生物活性，指在例如制药工业或诊断产业的某些应用中，例如由于混入工艺流中而存在的生物活性可能是非所需的。根据说明书在实验中鉴别了4,578,079中要求保护的片段，其中设计是用于选择性合成比先前显示细胞活性片段更小的肽。在4,578,079中陈述了测定显示出活性最小片段的这种方法。此外，作为上述讨论的’079的继续的美国专利6,180,610推断尽管四肽是决定性的，但多肽最适宜的大小是包括定义的四肽的六肽。也已经知道单个氨基酸可用以提供与所需靶分子作用的基团，如在层析中。例如弱阴离子交换剂Arginine SepharoseTM(精氨酸琼脂糖)(Amersham Biosciences，Uppsala，Sweden)由主要通过其α-氨基偶联到颗粒状琼脂糖基质的Arg氨基酸所组成。因此，商业上将精氨酸琼脂糖TM作为层析凝胶提供，其中颗粒平均大小总体上基本小于微载体要求的尺度。已经出现了其它增强微载体的细胞附着性质的包被材料。例证性实例是CytodexTM1(Amersham Biosciences，Uppsala，Sweden)，其由交联葡聚糖基质组成，其上包被有一种已知的静电结合细胞的聚阳离子包被材料即二乙基氨基乙烷(DEAE)纤维素。但是这种细胞附着和生长性质并不是对所有类型的细胞都是最适合的，例如低铺板率(plating-efficiency)细胞或分化型细胞或敏感型细胞。因此仍然需要改进的可选择的微载体类型。为进一步改进细胞附着性质，已经出现了包被有更复杂化合物的微载体。例证性实例是类似于CytodexTM1的CytodexTM3(Amersham Biosciences，Uppsala，Sweden)，由一种交联葡聚糖基质组成，但是基质包被一层酸变性的猪胶原。但是源自哺乳动物的胶原可限制CytodexTM3在某些方面的应用。美国专利6,214,618涉及用于细胞培养的微载体珠，并更具体的说，涉及在这类产物中避免动物蛋白的问题。推荐的解决方案是用酸性溶液洗涤苯乙烯共聚物和表面的三甲胺组成的微载体珠，使该微载体珠适合细胞培养。美国专利6,378,527(Chondros Inc.)涉及到一种手术操作，其中将病人的软骨细胞取出并快速增殖然后再移植入所述病人体内用于修复软骨。为增殖软骨细胞，这些细胞被培养、涂平板并最后生长到包含一种多糖衍生物的支架上，该衍生物通过多糖如葡聚糖和聚胺交联得到。更具体的说，该多糖首先被氧化成二醛衍生物，然后与无毒聚胺反应以形成亚胺交联结构，这个交联结构可进一步加氢形成更加稳定的胺键。公开的微载体的一个优点在于其使软骨细胞增殖和II型胶原形成。另一优点在于当其在体外应用时，该微载体将降解为无毒成分而留下软骨细胞在原位形成软骨组织。显然，仍需要有可选的和/或改进的用于细胞培养的微载体，同时也需要有新颖的制备这种微载体的方法。也更广泛的需要改进细胞和其它表面间的相互作用。这包括将分析表面用于多种应用例如药物筛选、生物活性化合物研究、细胞表面受体研究和环境污染物监测中。专利技术简述本专利技术一方面提供一种使细胞附着和细胞培养的新型微载体。根据本专利技术这可通过将阳离子化合物经胍基(例如基于电荷相互作用)固定到微载体表面实现。本专利技术另一方面提供一种用于细胞附着和培养的微载体，其不含有任何得自哺乳动物的产物。本专利技术的又一方面提供用于细胞附着和培养的微载体，其毒性和污染物容易控制。本专利技术另外的方面提供制备使细胞附着和细胞培养的新型聚阳离子微载体的方法。根据本专利技术这可通过一种方法实现，其中包含至少一个胍基的化合物与一个环氧化物激活的基质表面接触，从而固定于其表面。本专利技术又一个另外的方面提供细胞培养方法，其中在一个或多个包被了阳离子化合物的微载体表面在提供生存力的环境下培养细胞，所述细胞经阳离子包被提供的胍基附着于微载体。本专利技术进一步的方面及优点将在下文中详述。附图简述附图说明图1显示了实施例1中解释的本专利技术微载体上非洲绿猴肾细胞株系细胞(Vero细胞)培养中细胞数目如何随培养时间而变化。图2显示了实施例1中解释的本专利技术微载体上非洲绿猴肾细胞株系细胞(Vero细胞)培养中细胞数目如何随培养时间而变化。定义本文所用术语“微载体”以其常规含义用于支持细胞培养的颗粒状物质。因此，在本申请中，术语“微载体”用于指，其表面上固定有能使细胞附着的化合物的基质。术语“聚阳离子”微载体是指微载体表面的净电荷为正电荷。术语“基质”是指载体的核心，即可附着细胞的物质。术语基质的“表面”包括基质的外表面以及，如果基质多孔还包括孔表面。专利技术详述本专利技术的第一个方面涉及一种微载体，阳离子化合物经胍基固定到其表面。在上下文中，应理解术语“化合物”指被固定于微载体表面的一定量的所述化合物，而不是其单个分子。因此，由于每个微载体都固定优选包被有多个所述化合物分子，所以每个微载体将呈现出净正电荷，并因此可称为“聚阳离子”。在一个实施方案中，本专利技术微载体能够通过阳离子化合物与细胞间的电荷相互作用附着细胞。在上下文中，应理解“附着”指细胞被良好锚定足以使细本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种微载体，所述微载体的表面经胍基固定有阳离子化合物。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：J范阿尔斯蒂恩，H贝里，A布于尔林，
申请(专利权)人：阿默森生物科学有限公司，
类型：发明
国别省市：SE[瑞典]