降解dsRNA和合成RNA的方法技术

一种具有降解ｄｓＲＮＡ活性的蛋白质，也就是说，能够作用于长链ｄｓＲＮＡ以形成特定长度ｄｓＲＮＡ的蛋白质；一种特定长度ｄｓＲＮＡ的有效制备方法，所述方法包括在具有与核酸结合活性的蛋白质例如具有ＲＮＡ结合活性的蛋白质的存在下，用所述具有降解ｄｓＲＮＡ活性的蛋白质处理ｄｓＲＮＡ；以及使用所述具有与核酸结合活性的蛋白质来提高以ｄｓＲＮＡ合成为代表的ＲＮＡ合成反应的效率的方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及具有降解dsRNA的活性并具有产生特定长度dsRNA的活性的蛋白质，涉及使用所述蛋白质和具有与核酸结合活性的蛋白质(例如具有与RNA结合活性的蛋白质)以有效降解dsRNA的方法，还涉及使用具有与核酸结合活性的蛋白质和具有合成RNA活性的蛋白质以有效合成RNA的方法。
技术介绍
目前，已经报道了使用小dsRNA的基因工程技术。例如，RNA干扰(RNAi)是dsRNA以序列特异性方式降解mRNA而导致的基因表达受抑制的现象。有关dsRNA可用于基因沉默，首次是在秀丽新小杆线虫(Caenorhabditis elegans)的反义研究中发现的。1995年，Guo和Kemphues进行了一项实验用反义RNA抑制par-1基因。当添加反义RNA时，正如所预期的一样，par-1的表达受到抑制。令人吃惊的是，用作对照的有义RNA也抑制par-1的表达，导致par-1突变体的表型(参见例如非专利文献1)。在1998年，Fire等人解决了该矛盾。当使用RNA聚合酶合成反义RNA或有义RNA时，无意中以非特异性方式产生了少量的反向RNA(inverse RNA)。这表明，因污染而形成的dsRNA对基因沉默来说是至关重要的，而反义RNA或有义RNA都不能抑制基因表达；通过将反义RNA退火到有义RNA而形成的dsRNA则能够有效抑制基因表达(例如非专利文献2)。 在RNA干扰中，一种称为切酶(Dicer)的酶由dsRNA产生小RNA(短干扰RNA(siRNA))(例如非专利文献3)。据认为，在所述酶作用下产生的siRNA掺入到某种复合物即RNA诱导性沉默复合物(RISC)中，该复合物识别并降解靶mRNA。然而，在许多情况下，可能参与RNA干扰的有关因子的确切功能尚不清楚(例如非专利文献4)。有效产生dsRNA或siRNA，对于有效进行RNA干扰来说是重要的。切酶(Dicer)的实例是人切酶(例如非专利文献5)。重组切酶(例如非专利文献6)是由Gene Therapy Systems或Stratagene销售的。然而，尚未从上述重组切酶的固有酶学性质的细节上进行研究，看其是否能满足需要。而且，采用基因工程技术保留切酶在作用于dsRNA时优选产生dsRNA(siRNA)的活性、或者提高其产生效率所含有的最小结构域也未完全弄清楚。此外，也不清楚有效用于产生dsRNA的具体有效方法。与已报道用于siRNA的方法相同，使用由RNA聚合酶合成长度约为21个核苷酸的dsRNA的方法(例如非专利文献7)。如果合适的话，能有效产生RNA的方法可用于上述方法。非专利文献1Guo，S.等，Cell，1995，第81卷，第611-620页非专利文献2Fire，A.等，Nature，1998，第39卷，第806-811页非专利文献3Bernstein，E.等，Nature，2001，第409卷，第363-366页非专利文献4Tabara，H.等，Cell，2002，第109卷，第861-871页非专利文献5Zhang，H.等，The EMBO Journal，2002，第21卷，第5875-5885页非专利文献6Myers，J.W.等，Nature Biotechnology，2003，第21卷，第324-328页非专利文献7Donze，O.等，Nucleic Acids Research，2002，第30卷，第10期，e46。
技术实现思路
本专利技术所解决的问题 本专利技术所解决的问题是提供具有降解dsRNA的活性并具有产生特定长度dsRNA的活性的蛋白质，也提供有效产生可用于RNA干扰等的特定长度dsRNA的方法，也提供促进RNA合成的方法。解决问题的方法 本专利技术已经进行了深入研究以便解决上述问题。结果，本专利技术人通过分析切酶的功能结构域，已经发现具有降解dsRNA的活性并且具有作用于长dsRNA以产生特定长度dsRNA的活性的蛋白质。而且，本专利技术人已经发现，在具有与核酸结合活性的蛋白质(例如具有与RNA结合活性的蛋白质)的存在下，通过让具有降解dsRNA活性的蛋白质作用于dsRNA，能有效制备特定长度的dsRNA，而且具有与核酸结合活性的蛋白质也能提高RNA合成(以dsRNA合成为例)的反应效率。因此，完成了本专利技术。本专利技术的第一方面涉及具有降解dsRNA的活性并且具有作用于dsRNA以产生特定长度dsRNA的活性的蛋白质。根据第一方面，具有降解dsRNA活性的蛋白质优选具有切酶的功能结构域。例如，优选它由RNA酶IIIa、RNA酶IIIb和dsRNA结合结构域组成。所述蛋白质还可包含PAZ结构域。有可能通过使用第一方面的蛋白质，产生约15-30个碱基对的dsRNA作为特定长度的dsRNA。第一方面的具有降解dsRNA活性的蛋白质的实例是由SEQ ID NO4或17的氨基酸序列、或者由SEQ ID NO3或16的核苷酸序列所编码的氨基酸序列组成的蛋白质。或者，所述蛋白质可以是由在SEQ ID NO4或17的氨基酸序列中一个或多个氨基酸被取代、缺失、插入或添加的氨基酸序列组成的蛋白质。可以通过将密码子转变成适合于在宿主中表达的密码子，或者增强宿主使用罕用密码子，就能有效产生第一方面的具有降解dsRNA活性的蛋白质。此外，可以使用冷诱导型载体来表达所述蛋白质。另外，第一方面的蛋白质可以作为一种组分包含在试剂盒中。本专利技术的第二方面涉及降解dsRNA的方法，所述方法包括在具有与核酸结合活性的蛋白质的存在下，让具有降解dsRNA活性的蛋白质作用于dsRNA，以产生特定长度的dsRNA。根据第二方面，具有与核酸结合活性的蛋白质和具有降解dsRNA活性的蛋白质可以是融合蛋白。具有与核酸结合活性的蛋白质可以是具有与RNA结合活性的蛋白质。具有与RNA结合活性的蛋白质可以是冷激蛋白。所述冷激蛋白可来源于嗜热菌或耐热菌。尽管认为并不是对本专利技术的限制，例如，冷激蛋白的实例是来自海栖热袍菌(Thermotoga maritima)的冷激蛋白B。根据第二方面的方法，有可能产生约15-30个碱基对的dsRNA作为特定长度的dsRNA。而且，根据第二方面，具有降解dsRNA活性的蛋白质可以是第一方面的蛋白质，或者可以是天然切酶或其功能性等同物。本专利技术的第三方面涉及合成RNA的方法，所述方法包括在具有与核酸结合活性的蛋白质的存在下，使用具有合成RNA活性的蛋白质，进行RNA的合成反应。根据第三方面，具有与核酸结合活性的蛋白质和具有合成RNA活性的蛋白质可以是融合蛋白。具有与核酸结合活性的蛋白质可以是冷激蛋白。所述冷激蛋白可来源于嗜热菌或耐热菌。尽管认为并不是对本专利技术的限制，例如，冷激蛋白的实例是来自海栖热袍菌的冷激蛋白B。具有合成RNA活性的蛋白质可以是依赖DNA的RNA聚合酶。本专利技术的第四方面涉及用于第二方面的方法的组合物，所述组合物包含具有与核酸结合活性的蛋白质和具有降解dsRNA活性的蛋白质。本专利技术的第五方面涉及用于第二方面的方法的试剂盒，所述试剂盒包含具有与核酸结合活性的蛋白质和具有降解dsRNA活性的蛋白质。本专利技术的第六方面涉及用于第三方面的方法的组合物，所述组合物包含具有与核酸结合活性的蛋白质和具有合成RNA活性的蛋白质。本专利技术的第七方面涉及本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种具有降解ｄｓＲＮＡ活性的蛋白质，所述蛋白质具有作用于ｄｓＲＮＡ以产生特定长度ｄｓＲＮＡ的活性。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：佐川裕章，友野润，H上野，加藤郁之进，
申请(专利权)人：宝生物工程株式会社，
类型：发明
国别省市：JP[日本]