建立成年关中奶山羊皮肤表皮干细胞系的方法技术

本发明专利技术公开了一种建立成年关中奶山羊皮肤表皮干细胞系的方法，该方法将已脱离关中奶山羊体的耳中部一块０．５ｃｍ×０．５ｃｍ大小的皮肤，切成０．１～０．２ｃｍ×０．１～０．２ｃｍ的组织块，按表皮面朝上贴于玻璃或塑料平皿中，加培养基，在３７℃、５％ＣＯ↓［２］、饱和湿度的恒温培养箱内培养，培养后离散成单个细胞，用移胚管将单个细胞移入塑料皿中，用无血清培养基培养，待干细胞增殖至７０％～８０％融合时，用０．２％胰酶＋０．０２％ＥＤＴＡ进行消化传代培养，直至传至２５代，冷冻大量种子细胞，即为建立的成年关中奶山羊皮肤表皮干细胞系。本发明专利技术的方法建立的关中奶山羊皮肤表皮干细胞系，不仅可用于克隆转基因动物的研究和生产，而且可用于该品种的遗传特征研究与保种；同时也是组织工程皮肤研究的理想实验材料。

【技术实现步骤摘要】

【技术保护点】
一种建立成年关中奶山羊皮肤表皮干细胞系的方法，其特征在于，包括下列步骤：１）将已脱离关中奶山羊耳中部的一块０．５ｃｍ×０．５ｃｍ大小的皮肤，在无菌间用生理盐水冲洗数遍，去血污及毛发；２）在解剖镜下将皮肤与软骨分离；并将该皮肤 切成０．１～０．２ｃｍ×０．１～０．２ｃｍ的组织块，按表皮面朝上贴于玻璃或塑料平皿中，加培养基，培养基配方：９０％Ｍｅｄｉｕｍ１９９＋１０％ＦＢＳ＋１０μｇ／ｍＬＩｎｓｕｌｉｎ＋１０ｎｇ／ｍＬＬＩＦ＋（１－１．５μｇ／ｍＬ）氢化 可的松＋１００Ｕ／ｍＬ青霉素＋１００Ｕ／ｍＬ链霉素；在３７℃、５％ＣＯ２、饱和湿度的恒温培养箱内培养，每２ｄ换一次培养基；３）倒置显微镜下观察细胞生长情况：３ｄ～４ｄ后，在组织块四周有上皮样细胞呈铺路石样生长，７ｄ～１２ｄ后，在上皮 样细胞层上可见有小圆形细胞聚集生长；该类细胞的胞体透亮、折光性强、体积小、核质比高、细胞呈球形，具有干细胞形态学特征；４）待这些干细胞克隆增殖到直径约为１００ｕｍ～１５０ｕｍ时，在解剖镜下将其挑选出来，用０．２％胰酶＋０．０２％ＥＤ ＴＡ进行离散成单个细胞，用移胚管将单个细胞移入塑料皿中，塑料皿中铺有明胶；每皿接种５０００～１００００个细胞；５）用无血清培养基培养，第３天后换一次无血清培养基；此后每两天换一次无血清培养基；无血清培养基培养配方为：１００％Ｆ１２＋ （１％～１．２％）ＢＳＡ＋（２０～２５ｎｇ／ｍＬ）ＥＧＦ＋（１５～２０ｎｇ／ｍＬ）ＩＧＦ－１＋２０ｎｇ／ｍＬＬＩＦ＋０．０５μｇ／ｍｌ氢化可的松＋１００Ｕ／ｍＬ青霉素＋１００Ｕ／ｍＬ链霉素；６）待干细胞增殖至７０％～８０％融合时，用 ０．２％胰酶＋０．０２％ＥＤＴＡ进行消化传代培养，直至传至２５代，冷冻大量种子细胞，即为建立的成年关中奶山羊皮肤表皮干细胞系。...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：杨学义，窦忠英，
申请(专利权)人：西北农林科技大学，
类型：发明
国别省市：61[中国|陕西]