人谷胱甘肽-S-转移酶Pi的纯化方法及其该酶的应用技术

本发明专利技术公开了一种人谷胱甘肽－Ｓ－转移酶Ｐｉ的纯化方法，其方法步骤为：（１）将含表达载体ｐＥＴ－２８ａ／ｈＧＳＴｐｉ的Ｅ．ｃｏｌｉ　　ＢＬ２１／ＤＥ３菌株接种于ＬＢ固体培养基，振荡培养，离心收集菌体；（２）按每ｇ菌体沉淀加入ｐＨ７．９的结合缓冲液重悬收集菌体沉淀，经超声破碎、离心后取上清液，用缓冲液洗脱；（３）将洗脱上清用透析液１透析去咪唑，再用透析液２透析测定酶活性；（４）用ＰＢＳ缓冲液透析，用凝血酶水解切割Ｈｉｓ↓［６］标签，获得人谷胱甘肽－Ｓ－转移酶ｈＧＳＴｐｉ。本发明专利技术方法纯化得到的ｈＧＳＴｐｉ重组蛋白纯度高，且空气氧化形成的无活性二聚体少，ｈＧＳＴｐｉ在炎症治疗中的应用，不仅能有效控制炎症，而且对机体免疫系统的影响小，副作用极小。

【技术实现步骤摘要】

【技术保护点】
一种人谷胱甘肽－Ｓ－转移酶Ｐｉ的纯化方法，其纯化步骤如下：（１）、将含表达载体ｐＥＴ－２８ａ／ｈＧＳＴｐｉ的Ｅ．ｃｏｌｉＢＬ２１／ＤＥ３菌株接种于含卡那霉素１００ｍｇ／Ｌ的ＬＢ固体培养基，每升培养基含胰化蛋白胨１０ｇ，酵母提取物 ５ｇ，ＮａＣｌ１０ｇ，琼脂１５ｇ，用去离子水定容至１升，３７℃振荡培养１２ｈ，挑单菌落接种于含卡那霉素１００ｍｇ／ＬＬＢ液体培养基，每升培养基含胰化蛋白胨１０ｇ，酵母提取物５ｇ，ＮａＣｌ１０ｇ，用去离子水定容至１升，３７℃振摇培养１６ｈ ，然后取１ｍＬ接种到１００ｍＬＬＢ液体培养基，３７℃振摇培养２～４ｈ，ＯＤ↓［６００］达到０．５～０．６时，加异丙基β－半乳糖甘至终浓度为０．４ｍＭ，继续振摇培养４ｈ，１２，５００ｇ离心１０ｍｉｎ收集菌体；（２）、按每ｇ菌体沉淀 加５ｍＬ０．５ＭＮａＣｌ，２０ｍＭＴｒｉｓ－ＨＣｌ，５ｍＭ咪唑，ＰＨ７．９的结合缓冲液重悬诱导表达后收集的菌体沉淀，经超声破碎后，１２，５００ｇ，４℃离心１５ｍｉｎ后取上清，上清与经结合缓冲液预平衡过的ＩＤＡ－Ｎｉ↑［２＋］树脂 在４℃结合４０ｍｉｎ，用以上结合缓冲液洗涤柱３次，再用０．５ＭＮａＣｌ，２０ｍＭＴｒｉｓ－ＨＣｌ，６０ｍＭ咪唑，ＰＨ７．９的洗涤缓冲液洗涤２次，用０．５ＭＮａＣｌ，２０ｍＭＴｒｉｓ－ＨＣｌ，１Ｍ咪唑，ＰＨ７．９的洗脱缓冲液洗 脱３次；（３）、合并３次洗脱液上清，用０．５ＭＮａＣｌ，２０ｍＭＴｒｉｓ－ＨＣｌ，ＰＨ７．９的透析液１透析去咪唑，再用０．１Ｍ磷酸钾，１ｍＭＥＤＴＡ，ＰＨ６．５透析液２透析测定酶活性；（４）、用１４０ｍＭＮａＣｌ ，２．７ｍＭＫＣｌ，１０ｍＭＮａ↓［２］ＨＰＯ↓［４］，１．８ｍＭＫＨ↓［２］ＰＯ↓［４］的ＰＢＳ缓冲液透析测定蛋白浓度，用凝血酶水解切割Ｈｉｓ↓［６］标签，得到人谷胱甘肽－Ｓ－转移酶ｈＧＳＴｐｉ。...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：殷志敏，沈佳胤，罗兰，张泓，王宇，
申请(专利权)人：南京师范大学，
类型：发明
国别省市：84[中国|南京]