杂交酶制造技术

本发明专利技术涉及杂交酶，其包含至少一种碳水化合物结合模块氨基酸序列和至少葡糖淀粉酶氨基酸序列的催化模块。本发明专利技术还涉及这种杂交酶在淀粉处理以及尤其是乙醇产生中的用途。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】参考序列表该申请包含计算机可读形式的序列表。其在此处一并作为参考。
技术介绍
专利
本专利技术涉及至少一种碳水化合物结合模块(carbohydrate-bindingmodule，″CBM″)和至少葡糖淀粉酶的催化模块(catalyic module，CM)的杂交体及其它。本专利技术也涉及杂交酶在淀粉处理中的用途，在此处理中，颗粒淀粉降解为糖，例如，浆液(slurry)、或者可以用作产生发酵产物，尤其是乙醇所用的酵母的营养。相关现有技术描述已经描述了大量的将淀粉转化为淀粉水解产物，如麦芽糖、葡萄糖或特制浆液以用作甜味剂或作为其它糖类如果糖的前体的方法。葡萄糖也可发酵为乙醇或其它的发酵产物。淀粉是由葡萄糖单位的链所组成的高分子量多聚体。其通常由约80％的支链淀粉和20％直链淀粉组成。支链淀粉为支链多糖，其中α-1，4D-葡萄糖残基的线性链通过α-1，6糖苷键连接起来。直链淀粉是由D-吡喃葡萄糖单位通过α-1，4糖苷键连接在一起而构成的线性多糖。在将淀粉转化为可溶性淀粉水解产物的例子中，所述淀粉被解聚化。传统的解聚方法由糊化步骤(gelatinization step)和两个连续的处理步骤即液化处理和糖化处理所组成。颗粒淀粉由显微镜下可见的颗粒组成，其在室温下不溶于水。水性淀粉浆液加热时，颗粒膨胀并最终破裂，将淀粉分子分散到溶液中。在此“糊化”处理期间粘性急剧增加。由于典型工业处理中固体水平为30-40％，淀粉必须稀释或“液化”以使之能够处理。目前粘性的降低主要通过酶学降解获得。在液化步骤期间，长链淀粉被α-淀粉酶降解为更小的支链和线性单位(麦芽糊精)。通常，液化处理在约105-110℃实施约5到10分钟，接下来约95℃实施约1-2小时。然后将温度降至60℃，加入葡糖淀粉酶或β-淀粉酶和可选的脱支酶如异淀粉酶或支链淀粉酶(pullulanase)，糖化处理进行约24至72小时。传统的淀粉转化处理是非常耗能的，因为许多步骤中在温度方面有不同的需求。因此需要能够选择和/或设计此处理中所使用的酶以使整个过程能够在无需糊化淀粉的情况下进行。专利技术概述第一个方面本专利技术提供了包含具有葡糖淀粉酶活性的催化模块的氨基酸序列和碳水化合物结合模块的氨基酸序列的杂交酶。优选催化模块可以是真菌、细菌、或植物起源的。更多方面，本专利技术提供编码第一方面所述杂交酶的分离的DNA序列，包含编码第一方面所述杂交酶的DNA序列的DNA构建体，包含编码第一方面所述杂交酶的DNA序列的表达载体，用载体转化的宿主细胞，其中宿主细胞能够表达编码第一方面所述杂交酶的DNA序列。最后一方面，本专利技术提供由颗粒淀粉产生浆液或发酵产物的方法，包括用水性介质中的α-淀粉酶和本专利技术具有葡糖淀粉酶活性的杂交酶处理天然淀粉(raw starch)。当需要发酵产物时，所述方法包括发酵生物的存在。附图简述图l比较了包含埃默森篮状菌(Talaromyces emersonii)催化结构域和黑曲霉(A.niger)SBM的两个葡糖淀粉酶-SBM(淀粉结合模块)杂交体(TEAN-1和TEAN-3)与野生型埃默森篮状菌葡糖淀粉酶的每g DS的乙醇产量。专利技术详述术语“颗粒淀粉(granular starch)”理解为天然(raw)的未煮过的淀粉，即未被糊化的淀粉。淀粉作为不溶于水的微小颗粒在植物中形成。这些颗粒在低于起始糊化温度的温度中储存在淀粉中。当置于冷水中时，谷物可以吸收少量的液体。达到50℃至70℃时膨胀是可逆的，可逆程度依赖于具体淀粉。当温度更高时，称为糊化作用的不可逆膨胀开始。术语“起始糊化温度”理解为淀粉糊化作用开始时的最低温度。在水中加热的淀粉在50℃和75℃之间开始糊化；糊化的确切温度依赖于具体淀粉，熟练技术人员可以很容易地测定。因此，根据植物种类、植物种类的具体品种以及生长条件，起始糊化温度可以不同。在本专利技术的上下文中，给定淀粉的起始糊化温度为使用Gorinstein.S.和Lii.C.，Starch/St_rke，Vol.44(12)pp.461-466(1992)所描述的方法测定时，5％的淀粉颗粒中双折射(birefringence)消失时的温度。术语“可溶性淀粉水解产物”理解为本专利技术方法的可溶性产物，可以包含单糖、二糖、和寡糖，例如葡萄糖、麦芽糖、麦芽糊精、环糊精及其任何混合物。优选至少90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或至少99％的颗粒淀粉的干燥固体转化为可溶性淀粉水解产物。术语多肽“同源性”理解为两条序列之间的一致性程度，其表明第一条序列与第二条序列的衍生关系。可以使用本领域已知的电脑方法如GCG方法包中提供的GAP(Program Manual for the Wisconsin Package，Version 8，August 1994，Genetics Computer Group，575 Science Drive，Madison，Wisconsin，USA 53711)(Needleman，S.B.和Wunsch，C.D.，(1970)，Journal ofMolecular Biology，48，443-453)测定同源性。使用以下的氨基酸序列比对设置GAP产生罚分为3.0，GAP延伸罚分为0.1。杂交酶本说明书及权利要求中的酶分类号(EC编号)与生物化学与分子生物学国际联合会的命名委员会，Academic Press Inc.，1992所推荐(1992)的一致。此处所称杂交酶包括包含葡糖淀粉酶(EC 3.2.1.3)的氨基酸序列且其连接(即共价结合)至包含碳水化合物结合模块(CBM)的氨基酸序列的那些。术语“碳水化合物结合模块(CBM)”也可称“碳水化合物结合结构域(CBD)”。含CBM的杂交酶，及其制备和纯化的详述描述是本领域已知的。其可以通过例如将DNA构建体转化到宿主细胞中并培养该转化的宿主细胞以表达融合基因来制备，所述DNA构建体包含至少一个编码碳水化合物结合模块的DNA片段，该DNA片段通过或不通过连接子连接至编码目标葡糖淀粉酶的DNA序列，此DNA序列具有或不具有其自身的天然碳水化合物结合模块。所得的重组产物(杂交酶)-本领域通常称为“融合蛋白”-可以用下述的通式描述A-CBM-MR-X在后者的通式中，A-CBM为至少包含碳水化合物结合模块(CBM)本身的氨基酸序列的N端或C端区域。MR为中间区域(“连接子”)，X为由编码CBM所连接的酶(或其它蛋白)的DNA序列所编码的多肽的氨基酸残基序列。A部分可以不存在(这样A-CBM为CBM本身，即不包含除构成CBM的氨基酸残基之外的其它氨基酸残基)，或者可以为具有一个或多个氨基酸残基的序列(作为CBM本身的末端延伸体而发挥功能)。连接子(MR)可以不存在，或者是键，或者为包含约2至约100个碳原子，特别地2至40个碳原子的短的连接基团。然而，MR优选为约2至约100个氨基酸残基的序列，更优选2至40个氨基酸残基，例如2至15个氨基酸残基。X部分可以构成整个杂交酶的N端或C端区域。这样，由以上所述很明显所讨论的杂交酶类型中的CBM可以位于杂交酶的C端、N端或内部。在CBM位于内部的实施方案中，CBM可以通过两个连接子连接。应了解，本专利技术的杂交酶可本文档来自技高网...

【技术保护点】
杂交酶，包含具有葡糖淀粉酶活性的催化模块的氨基酸序列和碳水化合物结合模块的氨基酸序列。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：托本博彻特，斯蒂芬丹尼尔森，埃里克阿兰，
申请(专利权)人：诺维信北美公司，诺维信公司，
类型：发明
国别省市：US[美国]