重组腺病毒载体及其使用方法技术

本发明专利技术提供了一种重组腺病毒的表达载体，其特征是部分或全部缺失了腺病毒ＩＸ蛋白的ＤＮＡ且带有一编码外源蛋白或其功能性片段或突变体的基因。本发明专利技术也包括被转化的宿主细胞、重组蛋白的产生方法及基因疗法。因此，例如本发明专利技术的腺病毒载体可包含一外源基因用以表达对细胞周期有调控作用的蛋白质如ｐ５３，Ｒｂ或分裂激素，或对细胞死亡有诱导作用的蛋白质如条件性自杀基因胸苷激酶。（为了有效，后者须与胸苷激酶的代谢物一起使用。）（*该技术在2014年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术的背景本申请是1994年5月19日申请的美国申请号为08/233,777的部分继续申请，后者又是1993年10月25日申请的美国申请号为08/142,669的部分继续申请，在此其内容以其全文作为本申请的参考资料。本申请中通过在括号中和在权利要求书之前的著录叙述中的引用提及了各种出版物。为更完整地描述与本专利技术有关的技术的现状，在此将这些出版物作为本专利技术的参考资料。用于基因疗法的重组腺病毒的生产需要利用一可反式提供这些重组病毒所缺失的病毒E1区的基因产物的细胞株。目前唯一可获得的有用细胞株是1977年由Graham等首先描述的293细胞株。293细胞大约含有5型腺病毒基因组(Aiello(1979)及Spector(1983))的左端的12％(4.3kb)。通常被检测的用于基因疗法的腺病毒载体一般是Ad2或Ad5 DNA的缺失，从病毒基因组的5’端的约400bp缺失到5’端的约3.3kb，以形成2.9kb的E1区的完全缺失。因此在重组病毒的DNA序列和细胞株的Ad5 DNA之间存在约1kb的同源区。此同源区界定了一个在病毒和细胞的腺病毒序列之间可能发生重组的区域。如此之重组会产生带有获得了293细胞的Ad5 E1区的表型为野生型的病毒。这种重组事件被推测为在重组病毒的制备物中经常检测到野生株的原因并且已被直接证明是引起以Ad2为基础的重组病毒Ad2/CFTR-1(Rich等(1993))的野生型污染的原因。考虑到在C型腺病毒亚群中序列的高度同源性，若载体是基于任何C型腺病毒(1，2，5，6型)则这种重组便可能发生。在重组腺病毒的小规模生产中，引起污染的野生型病毒的产生可通过弃掉那些发现被污染了的病毒制备物的筛选过程中来控制。为满足遗传疗法的预计需求，随着病毒生产规模的不断增长，任意一批制备物被野生型病毒污染的机会以及提供无污染重组制备物的难度也会增加。今年将会有愈百万的新的癌症病例被诊断，而与癌有关的死亡将达50万(美国癌症协会，1993)，p53突变是与人类癌症有关的最常见的遗传改变，引起人类癌症的50-60％(Hollstein等(1991)，Bartek等(1991)，Levine(1993))。举例来说，基因疗法在治疗p53缺陷的肿瘤时的目标是通过恢复野生型p53基因的一正常的有功能的拷贝以恢复对细胞增殖控制。p53在细胞周期过程中起着关键作用，它抑制生长以便启动与DNA损伤有关的修复或细胞程序死亡(apoptosis)。目前野生型p53已被确认为由辐射或化疗试剂引起的细胞程序死亡的必需成份(Lowe等(1993)A和B)，由于p53突变在人类肿瘤中的高度流行，化学疗法和放射疗法难以治疗的肿瘤很可能部分是由于缺少野生型p53所致。通过向这些肿瘤重新提供有功能的p53可推测这些肿瘤会变得对通常与辐射和化疗诱致的DNA损伤相关的细胞程序死亡敏感。在成功的人肿瘤抑制基因治疗中关键的一点是能够影响癌细胞的关键部分。为此目的已在各种肿瘤模型中广泛探索了反转录病毒载体的用途。例如反转录病毒载体对肝恶性肿瘤的治疗几乎没有效果，这是由于这些载体不能达到体内基因治疗所需要的高水平的基因转导(Huber，B.E.等，1991；CarusoM.等，1993)。为了获得更持续的病毒产生源，研究人员试图通过将带有反转录病毒的细胞株直接注入固态肿瘤而克服与低水平的基因转导相关的问题(CarusoM.等，1993；Ezzidine，Z.D.等，1991；Culver，K.W.等，1992)。然而由于其繁琐及在病人中会导致对包装细胞株的炎症反应，这些方法在用于病人时难以令人满意。反转录病毒载体的另外一个缺点是它们要求正在分裂的细胞有效地整合并表达重组的目的基因(Huber，B.E.1991)。稳定地整合到关键性的宿主基因上会导致致病的疾病状态的发生和遗传。与反转录病毒及其它基因送递方法(综述可见Siegfried(1993))相比，重组腺病毒有明显优点。从未发现腺病毒会在人体中引起肿瘤而且它已被安全地用为活疫苗(Straus(1984))。通过用目的基因取代复制所必需的E1区可产生复制缺陷的重组腺病毒。由于腺病毒不会作为感染的正常结果整合到人基因组中，因此大大减少了用反转录病毒或腺病毒伴病毒(AAV)载体可能引起的插入突变的危险。不会稳定整合也导致了另一安全特点，因为被导入的基因的作用将是暂时的，这是由于随着正常细胞的持续分裂染色体外的DNA会逐渐丢失。稳定的高滴定度的重组腺病毒能以反转录病毒或AAV无法达到的规模进行生产，从而允许生产足够的材料以治疗庞大的发病人口。另外，腺病毒载体能在体内高效地将基因导入广泛的组织和肿瘤细胞。例如，已有人证明腺病毒介导的基因送递对于如囊性纤维变性(Rosenfeld等(1992)，Rich等(1993))及α1-抗胰蛋白酶缺陷(Lemarchand等(1992))之类的疾病的基因治疗有极大的潜力。虽然基因送递的其它方法如阳离子脂质体/DNA复合体目前也在被探索，但目前看来都不如腺病毒介导的基因送递有效。与治疗p53缺陷肿瘤一样，基因疗法对其它肿瘤的目的也是恢复对细胞增殖的控制。对p53来说，有功能的基因的导入恢复了细胞周期的控制，它允许由治疗药剂导致的细胞程序死亡，与此相似，基因疗法也同样适用于其它的可单独使用也可与其他治疗药剂一起使用的控制肿瘤细胞的细胞进程和/或引起细胞死亡的肿瘤抑制基因。另外，不编码细胞周期调控蛋白但直接导致细胞死亡的基因如自杀基因或对细胞有直接毒性的基因也可直接用于基因疗法以直接消除肿瘤细胞的细胞周期进程。无论将哪一个基因用于恢复对细胞周期进程的控制，此途径的理论的和实际的可行性是相同的，即获得高效的基因转导以表达出治疗剂量的重组产物。因此选择哪一个载体用于实现高效基因转导并对病人有最小的危险是关系到基因疗法能否成功的重要因素。故此需要能提供使基因治疗安全有效的高水平的基因转导效率和蛋白质表达的载体和方法。本专利技术满足了此种需要并同时提供了相关的优点。专利技术简述本专利技术提供了一种重组腺病毒表达载体，其特征是部分或全部缺失了腺病毒蛋白IX的DNA且有一编码外源蛋白或其有功能的片段或突变体的基因。转化的宿主细胞和产生重组蛋白及基因治疗的方法也包括在本专利技术的范围之内。因此举例来说，本专利技术的腺病毒载体可包含一外源基因以表达对细胞周期有控制作用的蛋白质如p53，Rb或分裂激素，或可诱导细胞死亡的蛋白质如条件性自杀基因胸苷激酶。(为了有效，后者必须与胸苷激酶的代谢物一起使用。)附图的简要说明附图说明图1显示了本专利技术的一个重组腺病毒载体。此构建物如图1所示进行安装。所形成的病毒带有一从356到4020位核苷酸的腺病毒序列的5’端缺失，且在除去完整的蛋白质IX编码序列的同时也去掉了E1a和E1b基因，保留了E1b和pIX基因共用的多聚腺苷酸位点以用于任一目的基因的转录终止。图2显示了p110RB的氨基酸序列。图3显示了编码成视网膜细胞瘤抑制蛋白的DNA序列。图4显示了在本专利技术范围之内的重组p53/腺病毒构建物的图示。此p53重组体以Ad5为基础，用由后接Ad2的三联前导cDNA的Ad2MLP(A/M/53)或人CMV(A/C/53)启动子驱动的1.4Kb的全长p本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种重组腺病毒表达载体，包括蛋白质ＩＸＤＮＡ的部分或全部缺失及编码一外源蛋白的基因。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：理查德J乔治里，肯N威尔斯，丹尼尔C曼尼瓦，
申请(专利权)人：坎吉公司，
类型：发明
国别省市：US[美国]