产生阻断人细胞因子生物活性的人抗体的高产量方法技术

本发明专利技术涉及含有ＩｇＧ同种型的天然人抗体作为活性成分的药物组合物，其中天然人抗体中和选自ＶＥＧＦ、ＩＦＮα、ＩＬ－４、ＴＮＦα和ＴＧＦβ的人细胞因子的活性，所述中和抗体至少抑制由量在０．００６ｎｇ至０．０５ｎｇ范围内的所述细胞因子体外诱导的最大生物学活性的５０％。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及含有抑制细胞因子生物活性的中和抗体的组合物、其制造方法及其用途。
技术介绍
细胞因子是由许多细胞(例如淋巴细胞、单核细胞、树突状细胞、肥大细胞、成纤维细胞)产生、对许多组织发挥自分泌、旁分泌和内分泌作用的蛋白质。细胞因子影响细胞存活、增殖、分化和迁移。可以根据细胞因子的活性将其概括地分类。一些细胞因子在通过产生细胞毒性淋巴细胞或NK细胞、经直接或间接作用诱导细胞死亡中是重要的(IFN-γ、TNF、IL-2、IL-15)。其它细胞因子参与过敏反应，例如IL-3、IL-4、IL-5、IL-9和IL-13。若干细胞因子是调节抗体产生所必需的(IL-4、IL-5、IL-6、IL-9、IL-10和IL-13)而其它细胞因子发挥促炎作用(IL-1、TNFα、IFN-γ、趋化因子)。其它细胞因子具有抗炎特性(TGF-β、IL-4、IL-10)。然而，该分类没有反映细胞因子与其细胞靶标之间相互作用的复杂性，不考虑激动剂和拮抗剂作用，该复杂性以重要冗余和多效性为特征。免疫系统和特别是细胞因子的这些特征解释了为什么由例如阻断细胞因子的抗体介导的对其作用机制的每个干扰导致了重要的体内效应。迄今为止，疫苗治疗策略主要靶向于抗原攻击物(包括微生物、细胞或过敏原)，但是没有集中在对抗细胞因子失调。然而，考虑在例如逃避免疫防御现象中或感染现象中涉及的细胞因子的关键作用，就作用于其活性或产生而言，细胞因子在患者体内的失活是目前正在寻求的目标，尤其对生物不具有容许有效平衡这些细胞因子的天然拮抗剂而言。人们知道例如抗细胞因子抗体，但是由于产生这些抗体的B细胞处于静息，它们的效价水平非常低。另外，这些天然抗体亲合力低并且不中和相应细胞因子的活性。值得一提的是，由诱导细胞免疫原位瘫痪(in situ paralysis)介导的宿主细胞免疫防御逃逸现象由许多癌症使用的策略组成，并且是其生存所必需的。最初，因为个体仍然能够对抗其它侵袭(例如感染)免疫抑制，保持局限在肿瘤水平。然而在后期，免疫抑制可能蔓延和泛化，超出化学治疗和放射治疗引起的效果，如转移扩散所示和如癌症患者对感染的高度易感性所示。概括而言，免疫系统控制逃逸由阻止免疫系统正常行使功能的免疫系统瘫痪(免疫抑制)引起。所述免疫抑制涉及由癌症细胞或由其环境产生的瘫痪因子，包括细胞因子。免疫系统细胞的局部瘫痪或免疫抑制因此代表使癌症细胞从宿主免疫系统逃逸的主要武器。由诱导细胞免疫防御原位瘫痪介导的宿主细胞免疫防御逃逸现象也是HIV使用的策略。在AIDS中观察到的广泛的免疫抑制其特征尤其在于抗原呈递细胞(特别为2型树突状细胞(DC2))过度产生IFNα。IFNα的免疫抑制活性是由于其诱导调节性T细胞(正式称为抑制性T细胞)产生IL-10细胞因子的能力。抑制细胞因子生物活性的第一个策略由给患者注射免疫原性构建体组成。例如，为了诱导B细胞识别目的抗原(例如细胞因子)，在本领域实施了多种免疫原性构建体。这些免疫原性构建体的一个实施方案由目的抗原和载体分子之间的共价偶联组成，所述被携带的分子携带由辅助T淋巴细胞(也称为“T辅助”细胞)识别的与主要组织相容性复合物(MHC)II类分子组合的结构，所述主要组织相容性复合物(MHC)II类分子活化淋巴细胞而产生多种细胞因子(包括IL-2)，细胞因子依次将活化对目的抗原特异的B细胞克隆。一旦被活化，对目的抗原特异的B细胞将增殖并产生对目的抗原特异的抗体，此即寻求的目标。一般而言，这类免疫原性构建体由目的抗原和载体分子之间的共价化学偶联产物组成，纯化步骤之后和去除非偶联产物之后，该构建体由具有充分说明的化学结构的终产物组成。然而，这类免疫原性构建体具有缺点，其中可以列举注射该构建体与出现抗靶向细胞因子的免疫应答之间的长时程。另外，当所述细胞因子影响免疫应答的强度或性质时，有时不可能用抗细胞因子免疫原性构建体对患者有效接种。事实上，例如在观察到高度免疫抑制的癌症或AIDS的情况下，为了有效，应当在疾病早期，特别是在免疫抑制非常严重之前施用免疫原性组合物。本领域因此需要能够治疗免疫系统崩溃的患者的抗细胞因子抗体。这些抗体直接作用于涉及免疫抑制或炎症过程的细胞因子。这类抗细胞因子抗体治疗至少能暂时恢复免疫应答，并因此可以在施用免疫原性组合物前使用。抗细胞因子抗体已为本领域所公知。例如，专利申请EP 1 285 930以及相应的美国专利N°US 6,509,015公开了人抗体，具体为与TNFα特异性结合的人重组抗体，其中TNFα是由许多细胞类型产生的细胞因子，因其在自身免疫病、感染或移植排斥中的作用而众所周知。也可以引用国际申请N°WO 00/56772，所述国际申请N°WO 00/56772公开了与人IL-2特异性结合、并中和其体内和体外活性的人抗体，优选重组体。最后可以引用美国专利申请N°2003/0099647，所述美国专利申请N°2003/0099647公开了与γ干扰素结合的制剂，特别是与γ干扰素选择性结合的抗体或抗原的结合结构域，并可以用于预防或治疗炎症或自身免疫病，例如风湿性关节炎或狼疮。考虑到上文回顾的细胞因子的关键作用，对具有结合目的细胞因子并(至少部分地)中和其生物活性的新抗体组合物长期存在需求。重要的是，这类组合物应当不昂贵、易于制备并可重复地合成。专利技术概述作为本专利技术的目的之一，本专利技术具有获得中和选自VEGF、IFNα、IL-4、TNFα和TGFβ的人细胞因子生物活性的人抗体的高产量方法，该方法至少包括步骤(a)纯化(i)个体血清中含有的免疫球蛋白，或(ii)个体B细胞产生的免疫球蛋白，事先以含有蛋白质免疫原杂络物的稳定免疫原性产物针对所述细胞因子免疫所述个体，其中蛋白质免疫原杂络物由(i)选自VEGF、IFNα、IL-4、TNFα和TGFβ的抗原蛋白质分子和(ii)载体蛋白质分子之间的组合组成，其中少于40％的抗原蛋白质(i)通过共价键与蛋白质载体分子(ii)连接。本专利技术也提供含有抗细胞因子天然人抗体作为活性成分的新组合物，所述抗细胞因子天然人抗体能克服上面公开的现有技术免疫原性构建体中面临的问题，本专利技术也提供已知的抗细胞因子抗体组合物的备选方案。选作活性成分的天然人中和抗体优选为多克隆或单克隆抗体，且多克隆抗体选自(i)从针对所述人细胞因子而免疫的人血清纯化的完整抗体级份；(ii)中和该细胞因子活性的单特异性多克隆抗体的纯化级份；(iii)从上述多克隆抗体(i)和(ii)获得的Fab或F(ab)’2片段。单克隆抗体优选自(i)细胞产生的抗体，其中细胞于(a)针对所述人细胞因子免疫的人类个体的B细胞和(b)抗体产生细胞系的细胞(例如骨髓瘤细胞)之间的细胞融合之后获得；(ii)细胞产生的抗体，其中细胞以编码免疫球蛋白的DNA转染或转化，所述免疫球蛋白再生由免疫诱导并存在于免疫患者血清中的抗体，事先从针对所述细胞因子免疫的人类个体的B细胞DNA分离所述DNA；(iii)从上述多克隆抗体(i)和(ii)制备的Fab或F(ab)’2片段；(iv)ScFv片段。专利技术详述根据本专利技术显示可以在针对所述细胞因子免疫人类个体之后产生具有高度中和人细胞因子活性能力的新的人抗体，不需要现有技术方法中面临的复杂的细胞筛选和纯化步骤。为了更加本文档来自技高网...

【技术保护点】
物组合物，其含有ＩｇＧ同种型天然人抗体作为活性成分，所述天然人抗体中和选自ＶＥＧＦ、ＩＦＮα、ＩＬ－４、ＴＮＦα和ＴＧＦβ的细胞因子的活性，该中和抗体至少抑制由该细胞因子体外诱导的最大生物活性的５０％。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：B比其尼，H勒布阿内克，D扎古里，
申请(专利权)人：尼奥瓦克斯公司，
类型：发明
国别省市：FR[法国]