抑制bcl-2基因表达的siRNA双链制造技术

本发明专利技术公开了四组ｓｉＲＮＡ双链序列，它们可抑制ｂｃｌ－２抗凋亡基因的表达，能有效地抑制Ｂｃｌ－２蛋白表达和翻译，从而减少Ｂｃｌ２蛋白合成，以求恢复细胞的正常凋亡调控能力，最终达到延缓肿瘤生长的目的，是很好的抗白血病和肿瘤细胞耐药性的小分子双链核酸药物。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及siRNA双链序列，尤其是抑制bcl-2基因表达的siRNA双链。
技术介绍
RNAi是双链RNA介导的转录后基因沉默(Post-transcriptional gene silencing，PTGS)，在此情况下启动子是活跃的，靶基因能被转录，但不能正常积累mRNA。各种体内外实验证实21-23个nt的短双链RNA，即siRNA(short interference RNA，siRNA)，可在哺乳动物细胞组织内引起基因封闭作用，其结构稳定，无须像反义核苷酸那样进行广泛的化学修饰以提高其半衰期，并能在低于反义核苷酸几个数量级的浓度下，使靶基因降至极低水平甚至完全“敲除”，从而产生缺失突变表型。siRNA的干预效应关键取决于其靶基因序列的选择，任一nt的错误均会导致RNAi效应的丧失，这种高度序列特异性使其对点突变、序列插入和缺失的选择性基因静寂有很重要的药理作用。已证明，siRNA技术可单独或与其它现有的治疗手段一同用于突变所致的疾病，如病毒感染、SBMA，还可用于治疗肿瘤。Bcl-2为一原癌基因，能够抑制细胞凋亡，与肿瘤的发生和耐药性的形成关系密切。基因治疗可以增加耐药细胞对药物的敏感性，并且具有较强的特异性和无毒性，为肿瘤MDR的逆转开辟了崭新的途径，优化了化学治疗，因而具有广阔的应用前景。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供抑制bcl-2基因表达的siRNA双链序列，以及进一步提供该siRNA双链在制药中的应用。为达上述目的，本专利技术的四对以bcl-2基因为靶标的siRNA的序列分别为siRNA2反义链5’-AAG CCG GCG ACG ACT TCT CCC CCT GTC TC-3’，正义链5’-AAG GGA GAA GTC GTC GCC GGC CCT GTC TC-3’；SIRNA3反义链5’-AAC ATC GCC CTG TGG ATG ACT CCT GTC TC-3，正义链5’-AAA GTC ATC CAC AGG GCG ATG CCT GTC TC-3’； SIRNA5反义链5’-AAA GCG TTC ACT CCC AAC CTG CCT GTC TC-3’，正义链5’-AAC AGG TTG GGA GTG AAC GCT CCT GTC TC-3’；SIRNA6反义链5’-AAG AAT GCA AAG CAC ATC CAA CCT GTC TC-3’，正义链5’-AAT TGG ATG TGC TTT GCA TTC CCT GTC TC-3’。上述各对siRNA序列可用于制备治疗肿瘤和白血病的药物。本专利技术依据Ambion公司在网上提供有设计工具软件，设计合成以bcl-2基因为靶标的6对siRNA，通过脂质体将合成的siRNA转入U251细胞株，以未转染细胞以及bcl-2的反义药物G3139为对照，经MTT法检测siRNA对细胞生长的抑制以及流式细胞仪检测细胞周期的改变，用RT-PCR和免疫组织化学法检测siRNA对bcl-2表达的抑制作用。结果表明MTT显示各时间点细胞生长以及存活率，在siRNA2、3、5、6与siRNA1、4组以及对照组和脂质体组间均有显著性差异(P＜0.05)。siRNA1、4组与对照组和脂质体组也有差异(P＜0.05)。siRNA1-6组与反义组在24和48小时均有差异(P＜0.05)，在72小时无差异(P＞0.05)。RT-PCR以及免疫组织化学法显示，siRNA2、3、5、6组bcl-2基因表达明显低对照组\脂质体组\反义组以及siRNA1、4间(P＜0.05)。流式细胞仪结果显示，siRNA1-6组以及反义组细胞阻滞于S期。结论体外转录合成的siRNA2、3、5、6可抑制U251细胞bcl-2基因的表达，效率可达50％以上。RNAi是双链RNA介导的转录后基因沉默，RNAi具有强大的细胞穿透能力，可在不同细胞间长距离传递和维持。21-23个nt的siRNA，可在哺乳动物细胞组织内引起基因封闭作用，siRNA的干预效应关键取决于其靶基因序列的选择，任一nt的错误均会导致RNAi效应的丧失，这种高度序列特异性使其对点突变、序列插入和缺失的选择性基因静寂有很重要的药理作用。siRNA结构稳定无须像反义核苷酸那样进行广泛的化学修饰以提高其半衰期，并能在低于反义核苷酸几个数量级的浓度下，使靶基因降至极低水平甚至完全“敲除”。siRNA主要通过脂质体转染、电穿孔、微注射以及质粒转入。bcl-2基因的易位和高表达与肿瘤的发生密切相关。现已发现，在血液、淋巴系统的多种恶性肿瘤、前列腺癌、结肠癌、卵巢癌和成神经细胞瘤的发生及不良预后有密切关系。bcl-2等凋亡抑制基因的高表达与肿瘤逃避机体的自稳机制密切相关。bcl-2可抑制多种生理条件下的致凋因素诱导的凋亡，从而为转移后的肿瘤细胞能够继续生存提供了条件。另有研究发现，高表达Bcl-2的瘤细胞对化疗药物耐药性增加。因此，降低或消除Bcl-2基因在肿瘤细胞中的过度表达，可解除Bcl-2对肿瘤细胞凋亡的抑制作用，促进肿瘤细胞死亡和增强肿瘤细胞对化疗药物的敏感性。本专利技术针对bcl-2基因设计合成6条siRNA，通过脂质体转入神经胶质瘤U-251，与G3139作对照评价其抑制bcl-2的效应。MTT、RT-PCR结果均显示siRNA2、3、5、6有明显的抑制效应，与空白对照组相比bcl-2表达降低50％以上，流式细胞仪结果显示细胞停滞于S期。实验结果提示反义核苷酸对bcl-2的抑制作用多发生在48h以后，而siRNA在用药后12h即有明显抑制效应，但MTT结果提示随着时间延长，抑制效率有所降低。本专利技术应用近年来基因治疗的崭新手段---siRNA，抑制bcl-2这一抗凋亡基因的表达，能有效地抑制Bcl-2蛋白表达和翻译，从而减少Bc l2蛋白合成，以求恢复细胞的正常凋亡调控能力，最终达到延缓肿瘤生长的目的，进而把它应用在肿瘤药物的制药中。附图说明图1～图9是用免疫组织化学法检测bcl-2蛋白的表达时显微镜下观察的各组U251细胞bcl-2蛋白表达形态图。图10是RT-PCR检测各组转染细胞bcl-2mRNA表达水平的电泳图。图11～图19是流式细胞仪观察的细胞转染后周期变化曲线图。图20是各组细胞S期细胞百份率对比图。具体实施例方式实施例1siRNA的合成。关于siRNA序列设计，Ambion公司在网上均提供有设计工具软件(参见www.ambion.com/techlib/misc/siRNA finder.html)依据试剂盒(美国Ambion公司)合成如下六对siRNA 表1、依据Ambion公司设计软件设计合成的六对siRNA序列实施例2MTT检测细胞对各对siRNA的敏感性。取对数生长期U251细胞，配制1.5×105/mL起始浓度细胞悬液加到96孔培养板内(美国Corning公司生产，)，每孔加100μL，设空白对照组、脂质体(美国Invitrogen公司)对照组、反义组(15μmol/L)、以及siRNA 1-6组(1μmol/L)。每组5孔，按分组于接种24h后，弃取上清，加siRNA 1-6或G3139，置37℃，饱和湿度，5％CO2培养箱中无血清继续本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种抑制ｂｃｌ－２基因表达的ｓｉＲＮＡ双链（ｓｉＲＮＡ５），其序列为：　　　　反义链５’－ＡＡＡ　　ＧＣＧ　　ＴＴＣ　　ＡＣＴ　　ＣＣＣ　　ＡＡＣ　　ＣＴＧ　　ＣＣＴ　　ＧＴＣ　　ＴＣ－３’，　　　　正义链５’－ＡＡＣ　　ＡＧＧ　　ＴＴＧ　　ＧＧＡ　　ＧＴＧ　　ＡＡＣ　　ＧＣＴ　　ＣＣＴ　　ＧＴＣ　　ＴＣ－３’。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：张洹，胡海燕，
申请(专利权)人：暨南大学，
类型：发明
国别省市：81[中国|广州]