利用基因工程技术培育托品烷类生物碱高产的颠茄及方法技术

本发明专利技术提供了一种利用基因工程技术培育托品烷类生物碱高产的颠茄的方法。其过程是用高保真ＲＴ－ＰＣＲ分离目的基因，构建携带目的基因的双元三价植物高效表达载体，采用转基因技术把目的基因导入颠茄高效表达；在特定的筛选和诱导条件下获得转基因的颠茄；并对转基因颠茄进行分子检测和化学检测，最终获得托品烷类生物碱含量大大提高的转基因颠茄。本发明专利技术不但提供了一种利用基因工程技术培育托品烷类生物碱高产的颠茄的新方法，而且可以为包括莨菪碱和东莨菪碱在内的托品烷类生物碱的生产提供一种新型优质药源。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于分子生物学、生理学、育种学以及基因工程等领域，为一种利用基因工程技术培育托品烷类生物碱高产的颠茄的方法，具体涉及目的基因的克隆、表达载体的构建、获得托品烷类生物碱高产的转基因颠茄的具体程序。本专利技术还提供利用基因工程获得的托品烷类生物碱高产的转基因颠茄及其培养的子代、再生植株、植物组织或种子。
技术介绍
颠茄(Atropa bellandonna)是民间传统的药用植物，为茄科颠茄属植物，是产生托品烷类生物碱的资源植物。托品烷类生物碱的生物合成途径已经阐明，编码限速酶的基因已经克隆，其中氮甲基腐氨转运酶和莨菪碱-6-羟化酶是该途径上最重要的限速酶。已经有研究报道，在莨菪发根中过量表达来源与黑莨菪的氮甲基腐氨转运酶基因和莨菪碱-6-羟化酶基因，使得东莨菪碱的含量比原始材料提高了9倍。本方面采用基因工程方法在颠茄过量表达来源于颠茄的氮甲基腐氨转运酶基因和莨菪碱-6-羟化酶基因，从而达到打破颠茄中托品烷类生物碱生物途径上的限速反应，最终培育出托品烷类生物碱高产的颠茄。
技术实现思路
本专利技术的第一目的是提供一种利用基因工程技术遗传改良颠茄的方法，该方法将转移颠茄的氮甲基腐氨转运酶基因和莨菪碱-6-羟化酶基因核苷酸的编码区到颠茄中高效表达，从而提高颠茄中托品烷类生物碱的合成能力。在本专利技术的另一方面，还提供了一种植物表达载体，它包含上述颠茄的氮甲基腐氨转运酶基因和莨菪碱-6-羟化酶基因核苷酸的编码区。在本专利技术的另一方面，还提供了一种用上述植物表达载体转化的宿主细胞。在实例中该宿主细胞是颠茄。本专利技术的技术方案如下 本专利技术分离出的两条DNA分子一条是颠茄的氮甲基腐氨转运酶基因的编码区，用引物fabpmt5’-ccggatccATGGAGGTCAACCACAACAATG-3’和rabpmt5’-ccgagctcTCAAAACTCAACCAAATCCCTC-3’可以从颠茄中扩增出来；另一条是颠茄的莨菪碱-6-羟化酶基因的编码区，用引物fabh6h5’-ccagatctATGGCTACTCTTGTCTCAAATTG-3’和rabh6h5’-cccacgtg TTAGGCATTAATTTTATATGGC-3’可以从颠茄中扩增出来。一种利用基因工程技术提高颠茄中托品烷类生物碱含量的方法，特征在于利用携带颠茄的氮甲基腐氨转运酶基因编码区和莨菪碱-6-羟化酶基因编码区的植物表达载体，采用任何转基因方法在颠茄细胞、组织、器官、植株中过量表达氮甲基腐氨转运酶和莨菪碱-6-羟化酶，从而提高颠茄中托品烷类生物碱生物合成能力。其步骤如下(1)采用基因克隆的方法获得颠茄的氮甲基腐氨转运酶基因编码区和莨菪碱-6-羟化酶基因编码区；(2)把颠茄的氮甲基腐氨转运酶基因编码区和莨菪碱-6-羟化酶基因编码区可操作地连于表达调控序列，形成植物表达载体；(3)获得颠茄的无菌外植体；(4)采用任何转基因方法转移颠茄的氮甲基腐氨转运酶基因编码区和莨菪碱-6-羟化酶基因编码区到颠茄细胞、组织、器官、植株中；(5)在特定的条件下筛选和鉴定颠茄转化子；(6)在适合的条件下培养的转基因的颠茄，获得转基因后代。本专利技术涉及的植物表达载体包含颠茄的氮甲基腐氨转运酶基因编码区和莨菪碱-6-羟化酶基因编码区的DNA。用上述方法获得的生命体，它是转基因的颠茄的细胞、组织、器官、植株。其特征为导入了在CaMV 35S启动子驱动下的颠茄氮甲基腐氨转运酶基因编码区和莨菪碱-6-羟化酶基因编码区，其氮甲基腐氨转运酶和莨菪碱-6-羟化酶表达水平得到大大提高，托品烷类生物碱合成能力得到大大提高，托品烷类生物碱含量液得到大大提高。在本专利技术中，可选用本领域已知的各种载体，如市售的载体，包括质粒等。在本专利技术中，术语“生命体”指颠茄的细胞、组织、器官、植株。在本专利技术中，术语“托品烷类生物碱”包括莨菪碱和东莨菪碱。在本专利技术中，术语“任何转基因方法”包括根癌农杆菌Ti质粒介导基因转化、发根农杆菌Ri质粒介导基因转化、植物病毒载体介导基因转化、如PEG介导基因转化、脂质体介导基因转化、电击法介导基因转化、超声波介导基因转化、显微注射介导基因转化、激光微束介导基因转化、基因枪法介导基因转化、花粉管通道介导基因转化、生殖细胞浸泡法介导基因转化。在本专利技术中，术语“在特定的条件下筛选和鉴定颠茄转化子”是指用在离体培养的条件下用抗生素(卡那霉素、潮霉素、G418等)选择出有抗生素抗性的颠茄的转化子；可以使用PCR、Southern杂交、Northern杂交和Western印迹等方法来鉴定颠茄的转化子。在本专利技术中，术语“在适合的条件下培养的转基因的颠茄，获得转基因后代”是指对经过鉴定的转化子离体培养，并检测氮甲基腐氨转运酶基因和莨菪碱-6-羟化酶基因的表达水平，筛选托品烷类生物碱高产的优良转化子进行培养，获得转基因后代。在本专利技术中，我们从颠茄中克隆氮甲基腐氨转运酶基因和莨菪碱-6-羟化酶基因的编码区，并构建了植物高效反义表达载体，并遗传转化颠茄，打破颠茄中托品烷类生物碱生物合成途径中的限速反应，推动代谢流往目标产物方向流动，提高颠茄中托品烷类生物碱的合成能力，从而提高颠茄中托品烷类生物碱的产量，然后筛选获得托品烷类生物碱高产的转基因颠茄进行培养，并获得转基因后代。具体实施例方式下面结合具体实施例，进一步阐述本专利技术。应理解，这些实施例仅用于说明本专利技术而不用于限制本专利技术的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如《分子克隆》(New YorkCold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例1颠茄氮甲基腐氨转运酶基因和莨菪碱-6-羟化酶基因编码区的克隆根据颠茄氮甲基腐氨转运酶基因(GenBank登录号AB018570)和莨菪碱-6-羟化酶基因(GenBank登录号AB017153)的全长序列，并根据植物双元载体pCAMBIA1304和pBI121的多克隆酶切位点，设计携带相应酶切位点的基因特异性引物分别扩增目的基因的编码区，用于构建植物表达载体。克隆颠茄氮甲基腐氨转运酶基因编码区的引物为fabpmt5’-ccggatccATGGAGGTCAACCACAACAATG-3’(作为上游引物，携带Bam HI酶切位点和5’末端的两个保护碱基cc)；rabpmt5’-ccgagctcTCAAAACTCAACCAAATCCCTC-3’(作为下游引物，携带SacI酶切位点和5’末端的两个保护碱基cc)。克隆颠茄莨菪碱-6-羟化酶基因的引物为fabh6h5’-ccagatctATGGCTACTCTTGTCTCAAATTG-3’(作为上游引物，携带Bgl II酶切位点和5’末端的两个保护碱基cc)；rabh6h5’-cccacgtg TTAGGCATTAATTTTATATGGC-3’(作为下游引物，携带Pml I酶切位点和5’末端的两个保护碱基cc)。从颠茄叶片中提总RNA(上海华舜生物工程有限公司的RNA提取试剂盒)，反转录成cDNA(TaKaRa RNA PCR Kit)，然后进行PCR扩增，PCR反应体系为50ul，包含去离子水，10×PCR buffer 5ul，dNTP 1ul，MgCl23ul，引物各1本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种分离出的ＤＮＡ分子，其特征在于，它包括：具有编码颠茄氮甲基腐氨转运酶基因核苷酸序列的编码区。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：廖志华，陈敏，杨春贤，兰小中，孙敏，付玉凡，张启堂，
申请(专利权)人：西南师范大学，
类型：发明
国别省市：85[中国|重庆]