制备有义RNA长链的方法技术

本发明专利技术提供一种合成并扩增有义ＲＮＡ链的方法。本发明专利技术的方法包括合成探针，所述特征可用于探测寡核苷酸和ｃＤＮＡ微阵列，以及减法和标准化文库。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及产生长的有义(sense)RNA链的方法。
技术介绍
人类基因组完整序列的完成提供了用于生物学研究的大量的DNA序列信息。人类基因组信息最显著的应用之一是微阵列技术。利用寡核苷酸或互补DNA(cDNA)的高密度阵列，可以从与疾病、癌症、细胞循环、与环境接触等有关的细胞活性产生大量的基因表达图谱。微阵列可以由cDNA、基因组DNA制得，最近发现可以由寡核苷酸引物制得。见例如Lockhart等，Nature 105827-836(2000)。先前，DNA片段被点在尼龙膜上，与放射性标记的探针杂交以筛选不同表达的基因。近来，采用玻璃片作为DNA点阵的基质，用荧光进行更有效的检测。研究显示基于寡核苷酸的微阵列比基于cDNA的微阵列在靶序列设计和检测方面有更好的特异性。至少有三种方法被用于制备测量基因表达的标记物质。例如，RNA可直接用光生物素化方法标记。或者，被标记的核苷酸可在逆转录反应中掺入cDNA，或者被标记的核苷酸可通过体外转录掺入反义RNA中。见例如Van Gelder等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 871663-1667(1990)。在此研究领域的一大困难是在制备用于阵列分析的标记物质时需要大量的RNA。见例如Wang等，Nature Biotech.18457-459(2000)。而大量的RNA不利于样品的微阵列杂交分析。现有的由少量起始材料制备RNA表达序列的技术扩增反义RNA，并通过将启动子引物掺入mRNA的polyA尾部(3’端)或第一链cDNA的5’端。此方法限制了可获得的RNA的质量。从被掺入polyA尾部的转录启动子进行转录的一个问题是大量RNA序列不能以全长形式出现，甚至完全没有出现，原因是5’外显子序列没有被转录，部分原因是在合成cDNA的第一链之前，发生了内含子剪切，并且3’未翻译区的长度是高度可变的，由几百个碱基对至几千个碱基。此外，由于大多数市售的合成寡核苷酸微阵列被设计为含有基因的编码序列，在这样的微阵列中从3’端扩增的反义mRNA很可能无法充分地表述表达的序列。最终的结构是在RNA群体中不能表示丰富的mRNA序列。本专利技术致力于解决这一问题。
技术实现思路
本专利技术提供产生长的有义RNA链(lsRNA)的方法。本专利技术的方法包括提供包含5’和3’末端的第一cDNA链；将包含启动子调节元件的启动子引物掺入第一cDNA链的3’端；合成与第一cDNA链互补的第二cDNA链；由此将启动子引物掺入双链cDNA；起始cDNA转录，由此产生长的有义RNA链。在一个实施方案中，掺入启动子引物是连接所述启动子引物。在一个实施方案中，通过逆转录掺入启动子引物。在一个实施方案中，第一cDNA链是从分离自生物样品的第一有义RNA链序列合成的。在进一步的实施方案中，生物样品包含微克量级以下的总RNA。在某些实施方案中，启动子调节元件新来自选自T7、T3和SP6的启动子。在某些方面，此方法进一步包括从有义RNA链合成第一cDNA链，并重复上述步骤。在一个实施方案中，第二cDNA链是通过PCR扩增合成的。在另一实施方案中，第二cDNA链是通过引物延伸合成的。在优选的实施方案中，产生的长的有义RNA链是全长RNA序列的转录物。具体实施例方式实施例1RNA分离按照标准的方法(例如用Life技术公司的Trizol试剂)，利用激光俘获显微术从细胞培养物或组织样本分离总RNA。用无RNA酶的DNA酶处理总RNA，以去除DNA污染物。用乙醇沉淀总RNA，将其溶解于无核酸酶的水中。用寡(dT)纤维素层析或用Oligotex mRNA分离试剂盒(Qiagen)从总RNA分离poly(A)RNA。第一cDNA链的合成在小的反应体积(5μl)中进行逆转录酶反应。简要地说，1μl的RNA与4μl的主混合物溶液混合。将混合物短暂地离心，在42℃下温育60分钟，在50℃下温育30分钟，然后在65℃下温育10分钟，使酶灭活。第一cDNA链的纯化在逆转录酶反应之后，通过RNA酶处理去除RNA。然后将cDNA在92℃下加热2分钟，立即在冰上冷却2分钟，再短暂离心。向cDNA中加入一种混合物，每一毫升的混合物含有0.1单位的Rnase I，和0.2的单位的Rnase H。在37℃下温育20分钟以进行RNA消化。然后加入2.5倍体积的冷乙醇(15μl)，用搅拌器(vortex)混合。在-80℃下或在干冰中保温5分钟后，在4℃，16000g下离心15分钟，使cDNA沉淀。用70％冷乙醇洗涤沉淀物，在空气中干燥，在蒸馏水中重新溶解。T7启动子引物连接如下设计T7启动子对于用T4 DNA连接酶的双链引物连接，使用以下两种互补引物退火。所述引物含有T7 RNA聚合酶启动子序列(下划线)T7N6 (+)5’-NH2-CGGCCAGTGAATTGTAATACGACTCACTA-TAGGCGCNNNNNN-NH2-3’T7-P-N (-)5’-P-GCGCCTATAGTGAGTCGTATTACAATTCACT-GGCCGTGTTT-NH2-3’ 引物T7N6在3’端含有简并序列。在引物合成时T7N6引物的两个末端都被氨基封闭。引物T7-P-N在5’端含有用于连接的磷酸基团，在3’端被氨基封闭。两种引物在92℃下退火2分钟，缓慢冷却至室温。用T4 RNA连接酶将T7启动子序列连接至3’cDNA末端。实施例2通过引物延伸合成第二链用于引物延伸或PCR扩增的引物包括T7PR-25’-AAACGACGGCCAGTGAATTGTAATACGACTCACTATAGG-3’此引物用于引物延伸或PCR扩增以将单链的第一cDNA链转变为双链cDNA。设计另一引物T7PR-2-Bio来进行引物延伸或PCR扩增，以将单链的第一cDNA链转变为双链cDNA。引物T7PR-2-Bio与T7PR-2相同，但含有5’生物素基团，此引物产生带有5’末端生物素标记的双链cDNA。通过引物延伸来合成第二cDNA链。实施例3用PCR合成第二链用聚合酶链式反应合成第二cDNA链。为了避免过多扩增造成样品失真，只进行有限次的PCR循环。PCR扩增后，将十分之一的PCR产物在用溴乙锭染色的1×TAE缓冲液中，在琼脂糖凝胶上进行分析。剩余的PCT产物用1μl的蛋白酶K在50℃下消化15分钟，用酚/氯仿抽提。实施例4本专利技术的有义mRNA链扩增方法与商业上可获得的反义mRNA扩增方法的比较纯化双链cDNA。商业上可获得的反义mRNA扩增方法可用例如Ambion公司或Arcturus公司的试剂盒进行。第一轮RNA扩增用Arcturus公司的试剂盒，进行大约8小时。对两种市售试剂盒而言，第一和第二轮扩增至少需要约2-3天。而本专利技术的方法仅需要大约8小时。在产生的mRNA的凝胶比较中，Ambion法或Arcturus法在第一轮的扩增后产生的最长反义mRNA链是大约1.5kb，在第二轮的扩增后产生的最长反义mRNA链是大约0.6kb。而本专利技术的方法在第二轮的扩增后产生的最长有义mRNA链是大约2.2kb。因此，本专利技术的方法比其他方法产生了长得多的mRNA序列。权利要求1.一种产生长的有义RNA链的方法，该方法包括提供包含5’和3’端的第一cDNA链；将包含启动子调节本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种产生长的有义ＲＮＡ链的方法，该方法包括：提供包含５’和３’端的第一ｃＤＮＡ链；将包含启动子调节元件的启动子引物掺入第一ｃＤＮＡ链的３’端；起始从ｃＤＮＡ的转录，由此产生长的有义链。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：许军普，秦晓华，赵峰，
申请(专利权)人：北京雅康博生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]