特异性沉默nm23-H1的siRNA序列及其载体和应用制造技术

本发明专利技术提供了一种能有效地特异性沉默基因ｎｍ２３－Ｈ１的ｓｉＲＮＡ序列及其载体和在制备治疗白血病和淋巴瘤药物中的应用。根据ｓｉＲＮＡ对应的起始ＡＡ在ｍＲＮＡ序列上的位置，分别命名为ｓｉＮＭ４９７、ｓｉＮＭ５２６，并且把这两对有效的ｓｉＲＮＡ分别克隆到ｐＳｉｌｅｎｃｅｒ　　４．１－ＣＭＶ　　ｎｅｏ载体上，获得能实现对ＮＭ２３－Ｈ１基因干扰，且可以稳定转染细胞的ｓｈＲＮＡ表达载体，通过转染该载体进入细胞，经由Ｇ４１８压力筛选建立稳定沉默ｎｍ２３－Ｈ１基因的细胞株，使得ＲＮＡ干扰作用持续数星期甚至更久，有利于进行较长期研究。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于基因工程
，特别涉及一种能有效地特异性沉默基因nm23-H1的siRNA序列及其相对应的shRNA表达载体pSilencerTM4.1-CMV-siRNA和应用。
技术介绍
至今发现的人体内nm23基因家族数目有8个nm23-H1、nm23-H2、DR-nm23、nm23-H4、nm23-H5、nm23-H6、nm23-H7、nm23-H8，在细菌、酵母、植物、果蝇、鼠及人中具有很大的同源性。其中研究最广泛的是与肿瘤转移相关的nm23-H1。nm23-H1基因位于17号染色体长臂17q21.3-17q22之间，其cDNA全长576bp，含有5个外显子和4个内含子；其蛋白产物为NDPK-A，含有152个氨基酸，分子量为17kD。NDPK蛋白包括两个蛋白激酶C(PKC)磷酸化位点、一个酪蛋白激酶II(CK2)磷酸化位点、一个酪氨酸激酶磷酸化位点、一个N-肉豆蔻酰化位点、一个细胞黏附序列和一个核苷酸激酶激活位点，晶体图和生物化学资料表明，细菌和真核生物中的NDPK分别以四聚体和六聚体形式存在。nm23-H1广泛分布于生物体内，在细胞的细胞核、细胞质、细胞膜、线粒体、微管和组织液中都可检测到它的存在。nm23-H1的生物学功能和它在细胞中所处的位置有关，如参与调控肿瘤转移，信号传导，转录调控，调节细胞增殖、分化、迁移和调亡等。除NDPK活性、结合DNA、DNA核酸酶活性、组氨酸、丝氨酸和苏氨酸，天门冬氨酸激酶活性外，nm23-H1还与P53基因、ras基因相关的GTP酶Rad，Rho家族成员Racl，甲状腺激素受体基因c-erbA/TR，Menin基因等众多因子间有交互作用。nm23-H1基因与肿瘤的关系非常密切，NM23-H1表达水平与肿瘤转移的关系可以分为3类(1)与肿瘤转移呈负相关黑色素瘤、肺癌、乳腺癌、胃肠癌、唾液腺癌、卵巢癌、肝癌、前列腺癌、结肠癌、上尿道癌、喉癌等；(2)与肿瘤转移呈正相关恶性淋巴瘤、非何杰金淋巴瘤、白血病、胰腺癌等；(3)与肿瘤转移无明显相关性直肠癌、鼻咽癌。nm23-H1基因除参与调控肿瘤转移之外，还与细胞的增殖、分化及个体发育等有关，另有研究表明nm23-H1基因表达有促进细胞凋亡和抗氧化作用。对大量临床病例的研究表明，在白血病、淋巴瘤等恶性血液病中，nm23-H1基因的表达与恶性程度呈正相关，与病人的存活时间呈负相关，其高表达可作为此类癌症预后不良的指标之一。因此，研究nm23-H1基因的多能性及其调控机制对于阐明细胞增殖和分化、肿瘤发生、发展和转移，甚至个体发育，都有重要意义。目前，利用RNA干扰技术针对某个已知的基因，设计可诱导其沉默的siRNA，通过合适的手段导入细胞或机体，使该基因表达水平下降或完全沉默，阻止相应蛋白的表达，不仅具有理论意义，而且具有实用价值，在基因治疗中有着广阔的应用前景。siRNA对靶基因的抑制效率明显高于反义核酸，与反义核酸相比，siRNA用量更低，并且克服了反义核酸的一些缺点，如寡聚物易降解，细胞摄取效率低，寡聚物的非特异性结合，对mRNA的非特异性阻断等。化学合成的siRNA能快速地转入细胞中并且发生作用，但与此同时，化学合成的siRNA费用高，容易降解，仅瞬时表达，且其作用只能持续一周时间。不利于进一步长期稳定地进行机理研究。
技术实现思路
为了解决上述现有技术中存在的不足之处，本专利技术的首要目的在于提供一种能够有效地特异性地沉默nm23-H1基因的siRNA序列。本专利技术的另一目的在于提供能够稳定表达上述siRNA序列的pSilencerTM4.1-CMV-siRNA表达载体。本专利技术的再一目的在于提供上述siRNA序列在制备治疗白血病和淋巴瘤药物中的应用。本专利技术的又一目的在于提供上述载体在制备治疗白血病和淋巴瘤药物中的应用。本专利技术针对nm23-H1基因的siRNA序列，可以是化学合成的也可以是通过表达载体稳定表达。针对nm23-H1基因的siRNA序列，可以通过脂质体、生物材料载体、病毒载体等形式来输送siRNA序列。本专利技术针对nm23-H1基因的编码区序列，根据相对应的siRNA设计原则设计两对siRNA序列，并且通过转染几种肿瘤细胞(如人肺腺癌细胞株A549和人慢性髓性白血病细胞株K562等)，检测了它们对nm23-H1基因的沉默效率，证实了其有效性和特异性。然后，将这两对有效的siRNA片段设计成能够插入pSilencerTM4.1-CMV neo载体中的发夹siRNA插入片段，构建能够稳定表达shRNA的pSilencerTM4.1-CMV-siRNA表达载体。本专利技术的目的通过下述技术方案实现本专利技术为设计靶向nm23-H1mRNA的siRNA序列，首先从NCBI GeneBank，获得nm23-H1全mRNA序列，编号X17620，序列全长732bp，其编码区序列(CDS，coding sequence)位于1～543bp。在相关的siRNA设计网站上进行初步设计和筛选，然后对比设计原则筛选潜在的siRNA序列，最终获得两对siRNA序列，根据siRNA对应的起始AA在mRNA序列上的位置，分别命名为siNM497、siNM526。所述特异性地沉默nm23-H1基因的siRNA序列分别为siNM497 Sense strand(正义链) 5′-CUGGUAGAUUACACGAGCUTTAnti-sense strand(反义链) 5′-AGCUCGUGUAAUCUACCAGTTsiNM526 Sense strand(正义链) 5′-CUGGAUCUAUGAAUGACAGTTAnti-sense strand(反义链) 5′-CUGUCAUUCAUAGAUCCAGTT一种包含上述siRNA序列的pSilencerTM4.1-CMV-siRNA表达载体，该表达载体能够稳定表达上述siRNA序列，按下述方法构建而成将特异性地沉默nm23-H1基因的siRNA序列设计成能够插入载体中的发夹siRNA插入片段，然后与pSilencerTM4.1-CMV neo载体连接，构建得到pSilencerTM4.1-CMV-siRNA表达载体；所述插入片段包含有19个碱基对的siRNA作用片段、一个环(loop)、3’端突出两个碱基、以及在两端的BamH I和HindIII酶切位点。一种能稳定抑制基因nm23-H1表达的细胞株，该细胞株按下述方法构建而成采用阳离子脂质体lipofectamineTM2000将上述两个表达质粒分别导入人肺腺癌细胞株A549或人慢性髓性白血病细胞株K562中，转染48小时后加入G418筛选抗性细胞，30～60d完成筛选，得到能够稳定表达siRNA的细胞株。上述的siRNA序列在制备治疗白血病和淋巴瘤药物中的应用。针对nm23-H1基因的siRNA序列，可以用于白血病和淋巴瘤的治疗。上述的表达载体在制备治疗白血病和淋巴瘤药物中的应用。为了检测证实所设计的两对siRNA的有效性，分别将这两对siRNA转染进入几种肿瘤细胞系(如人肺腺癌细胞株A549和人慢性髓性白血病细胞株K562)，通过检测基因nm23-H1的mRNA表达水平和相应的蛋白质NDPK的表达水平的变化，评价上述两对s本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种特异性地沉默ｎｍ２３－Ｈ１基因的ｓｉＲＮＡ序列，其特征在于所述ｓｉＲＮＡ序列为：　ｓｉＮＭ４９７：正义链５′－ＣＵＧＧＵＡＧＡＵＵＡＣＡＣＧＡＧＣＵＴＴ；反义链５′－ＡＧＣＵＣＧＵＧＵＡＡＵＣＵＡＣＣＡＧＴＴ。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：王一飞，钱垂文，张美英，刘格，
申请(专利权)人：暨南大学，
类型：发明
国别省市：81[中国|广州]