本发明专利技术涉及生物技术领域，具体地说关于一种可诱生细胞免疫应答的ｐＧＬ３／ＣＤ８０－Ｐ１Ａ共表达载体和ｐｃＤＮＡ３．１／Ｂ２Ｍ－ＩＬ１５真核表达载体。本发明专利技术所公开一种可诱生细胞免疫应答的ｐＧＬ３／ＣＤ８０－Ｐ１Ａ共表达载体和ｐｃＤＮＡ３．１／Ｂ２Ｍ－ＩＬ１５真核表达载体，其优点表现在：本发明专利技术有利于克服常规表位ＤＮＡ疫苗免疫原性低的缺陷，可用于肿瘤及病毒持续性感染等的预防和治疗。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物
，具体地说关于一种可诱生细胞免疫应答的pGL3/CD80-P1A共表达载体和pcDNA3.1/B2M-IL15真核表达载体。
技术介绍
DNA疫苗(DNA vaccine)又称核酸疫苗、基因疫苗(gene vaccine)，是指将编码某种目的抗原蛋白的外源基因插入真核细胞表达质粒，直接导入动物体细胞内，并通过宿主细胞的表达系统合成抗原蛋白，诱导宿主产生对该抗原蛋白的免疫应答，从而达到预防和治疗疾病的目的。核酸疫苗不仅能刺激机体产生特异性的体液免疫，还能诱导产生特异性的具有细胞毒杀伤性功能的CTL效应(细胞免疫)，并可直接清除带有目的抗原的靶细胞，因此对病毒、细胞内寄生的细菌和寄生虫所引起的传染病具有广阔的治疗前景。表位疫苗(epitope vaccine)是用抗原表位制备的疫苗，包括合成肽疫苗(synthetic peptide vaccine)、重组表位疫苗(recombinantepitope-based vaccine)及表位DNA疫苗(epitope DNA vaccine，minigenes/epigenes)，是目前研制感染性疾病和恶性肿瘤疫苗的方向。表位(epitope)是抗原分子中决定抗原特异性的特殊化学基团，又称抗原决定簇(antigenic determinant)，它是T细胞抗原受体(T cell receptor，TCR)和B细胞抗原受体(B cell receptor，BCR)及抗体特异结合的基本单位。在免疫应答中，TCR和BCR所识别的抗原表位不同，分别称为T细胞表位和B细胞表位。主要组织相容性复合体(major histocompatibilitycomplex，MHC)是高度多态性的细胞表面分子，它将多肽片段递呈给T细胞。与MHC I类分子结合的抗原肽为8-12个氨基酸，是来自内源性抗原经蛋白酶降解后的产物。蛋白酶水解片段通过抗原加工相关转运体(transporterassociated with antigen processing，TAP)转运至内质网与新合成的MHCI类分子相结合，MHC肽复合体转移至细胞表面被CD8+细胞毒T淋巴细胞的TCR识别。MHC II类分子结合肽长度变化较大，为9-25个氨基酸，主要由外源蛋白通过溶酶体中的蛋白酶降解而来。在内体溶酶体中与MHC II类分子结合后，MHC肽复合体也转运至细胞表面被CIM T细胞TCR识别。据此可设计出两大类T细胞疫苗，即与相应的MHC I及MHC II类分子相关的CD8 T细胞疫苗和CIM T细胞疫苗。CIM辅助性T细胞(helper T cell，Th)又分为分泌不同细胞因子却又交叉调节的两群，即Th1和Th2。DNA疫苗作为第三代疫苗，与血源疫苗和基因工程疫苗相比，具有以下优点在宿主体内合成所编码的蛋白质，具有与天然抗原相似的构象；能诱导机体产生全面的免疫应答；免疫应答持久；易于制备，化学结构稳定，便于保存和运输；可将编码不同抗原的基因构建在同一质粒中或将不同抗原基因的多种重组质粒联合应用，制备多价核酸疫苗；给药途径多样化等，为预防和治疗各种疾病提供了一种重要的思路。但是，由于机体组织对导入质粒有一定程度的破坏，外源基因的转染率较低，导入基因在体内不能也不应自我复制，都限制了核酸疫苗的使用效果。在免疫效果方面，总体而言动物尤其是小动物的试验效果优于人体试验，国内外研究者正谋求以多种方式提高免疫效果，如使用佐剂、改进导入方式、优化表达序列、多抗原表位结合等，使用的剂量也倾向加大。因此，如何增强核酸疫苗的免疫原性成了当前研究的重点。已有的增强DNA疫苗免疫效率的策略主要包括①优化外源基因编码序列核酸疫苗不含病原体的蛋白合成系统，完全依赖于宿主细胞凋控，将外源基因优化为宿主细胞偏好的密码子，可改善目的抗原的合成，进而促进免疫效果。研究表明，选用人体细胞偏好的密码可提高翻译效率，促进蛋白表达，显著提高细胞和体液免疫反应。②细胞因子的免疫佐剂效应细胞因子是体内免疫细胞或非免疫细胞产生的一组具有广泛生物学活性的异质类肽性调节因子，在体内能激活和调节免疫活性细胞，对免疫应答的产生和调节具有重要作用。业已发现多种细胞因子具有免疫佐剂作用，可调节免疫应答的强度和方向。Th1细胞主要产生IL-2、IFN-γ，在促进细胞免疫、清除细胞内病原体方面具有优势，Th2细胞主要分泌IL-4、IL-5、IL-6、IL-10，以促进抗体产生为主，而IL-10又对Th1细胞因子产生明显的抑制作用，从而形成免疫调控网络。以细胞因子作为佐剂，可望提高核酸疫苗的免疫效果。在使用方式上，除可直接使用细胞因子外，还可以细胞因子基因与疫苗质粒共免疫，或构建二者的共表达质粒。③共刺激分子的佐剂效应共刺激分子如B7、ICAM-1、VCAM-1、LFA-3等T细胞激活的第二信号，目前研究较多的是B7-1和B7-2分子。T细胞受体与抗原结合产生T细胞活化的第一信号，而T细胞表面的CD28与抗原递呈细胞表达的B7分子结合产生第二信号，T细胞只有同时受到这两种信号的刺激，才能被充分活化。缺乏B7等共刺激分子提供的第二信号，则可能导致T细胞的凋亡或产生免疫耐受。④增加CpG免疫刺激序列(ISS)近年来发现一些非甲基化脱氧核苷酸片断(CpG DNA)能增加核酸疫苗的免疫效果，以细胞免疫反应尤为明显，因此称之为免疫刺激序列(ISS)。免疫刺激序列的基本骨架为5’-嘌呤-嘌呤-CpG-嘧啶-嘧啶-3’，主要来源于细菌DNA，合成的相同序列具有相似的免疫增强作用，但是甲基化修饰或改变序列，则免疫刺激作用完全消失。CpG免疫刺激序列增强免疫反应的机理可能是直接诱导B细胞增殖活化并分泌IL-2、IL-6，保护B细胞免受细胞凋亡作用，刺激单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞活化分泌TNF-α、IL-6、IL-12，刺激T细胞、NK细胞分泌IFN-γ。总之，CpG诱导Th1类细胞因子产生，增加特异性IgG2a抗体的产生，增强CTL反应。核酸疫苗可通过多种途径及方式接种到机体内，肌肉、皮下、皮内、静脉、腹腔、粘膜都可以是核酸疫苗的接种部位，合适的接种途径和方式有利于提高蛋白表达水平和减少个体差异对免疫应答效果的影响。肌纤维是已永久地有丝分裂后的细胞，转入的DNA不会因为细胞分裂而较快地稀释或丢失，可长期稳定表达。所以，肌肉注射成为最常用的DNA疫苗注射方式。不过，肌纤维对DNA的摄取效率低是重要的限制因素，可将局部肌肉组织经物理或化学因素处理(如局部冷敷、注射麻醉剂或蛇毒、心肌毒素等)，产生炎症反应，损伤的肌细胞在增生过程中，可增加质粒摄入，使目的抗原表达量增多。电脉冲技术的作用机制是使细胞膜双层磷脂结构在电场的作用下发生改变，形成瞬间可逆的微孔，于是DNA或其他物质分子得以进入细胞。在体电脉冲(in vivo electroporation，又称电穿孔技术)正是用上述这种基本原理，使得DNA能够注入到活细胞内以提高其治疗效果。同时，由于电脉冲造成组织的轻微损伤产生了局部组织的炎症反应，可增强抗原递呈细胞(APC)功能，从而进一步提高了DNA疫苗的免疫原性，诱导机体产生更强的免疫应答。另外，在体电脉冲技术增强DNA疫苗的免疫效果较常用的基因枪方本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种可诱生细胞免疫应答的ｐＧＬ３／ＣＤ８０－Ｐ１Ａ共表达载体，它的核苷酸序列如ＳＥＱＩＤＮＯ：２所述。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：张兴黔，钱关祥，梅文瀚，方丽娟，钱丽，
申请(专利权)人：上海交通大学医学院，
类型：发明
国别省市：31[中国|上海]
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