具有反式互补的基因组缺陷的呼吸道合胞病毒制造技术

本发明专利技术涉及包含病毒基因组的肺病毒的病毒体，其中所述病毒基因组在编码肺病毒感染性所必需的蛋白质的基因中存在突变，其中该突变导致仅由该病毒基因组产生的病毒缺乏感染性，并且病毒体包含病毒体感染性所需形式和量的所述蛋白质。本发明专利技术涉及生产肺病毒的病毒体的方法，和涉及在预防或治疗肺病毒感染和疾病中使用该病毒体的方法。优选的肺病毒病毒体是呼吸道合胞病毒的病毒体，优选其中Ｇ附着蛋白基因被失活并反式互补。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及疫苗接种领域，更具体地是涉及针对由肺病毒(例如呼吸道合胞病毒(RSV))引起的疾病的疫苗。本专利技术涉及携带RSV基因组的RSV病毒体，其中RSV基因组中的对于感染性所必需的基因已经失活，而相应的野生型基因产物对病毒体构成反式互补。本专利技术还涉及生产所述RSV病毒体的方法和它们在疫苗上的用途，以及涉及生产针对肺病毒进行疫苗接种的方法。
技术介绍
人呼吸道合胞病毒分类上属于肺病毒(Pneumovirus)属，副粘病毒科。它是婴儿、老年人和免疫缺陷个体中急性下呼吸道疾病的主要病因。它也是青少年和成年人中上呼吸道疾病的重要病因。目前该领域中没有有效的h-RSV疫苗。RSV是RNA包膜病毒，其在表面表达两个主要抗原附着蛋白G和融合蛋白F。两个蛋白都显示可激发保护性抗体。G是两个已知h-RSV亚组A和B的决定簇。在这两组中发现了抗原差异。G蛋白表现出高度变异，其在组A和组B中仅有53％的氨基酸同源性，并且在组A的G蛋白序列中表现多达20％的差异(Mufson 1988，Cane 1991)。目前，使用以RSV富集的免疫球蛋白(Respigam)或合成的人源抗F单克隆抗体(Palivizumab)的被动式免疫处理，来用于处理和保护一些易患病的未满月婴儿(如早产婴儿)免受RSV感染(Robinson 2000，Greenough 2000)。RSV病理有两个主要方面由病毒自身引起的细胞伤害和由过度反应的免疫系统引起的组织伤害。后者在疫苗设计中是高度复杂的因素。RSV感染是季节性的，限于冬季并且在北半球高峰期是在年底左右。RSV可感染每一个两岁之前小孩，很多病例被感染过两次。较大的个体平均每隔一年被感染，这取决于环境；紧密接触婴儿和小孩的人具有50％的风险。病毒通过紧密接触以飞沫或污染表面进行传播。RSV不能有效地通过气溶胶传播；病毒颗粒相对不稳定。在初次感染期间，病毒从上呼吸道(URT)到下呼吸道(LRT)的体内传播主要通过吸入在URT上皮细胞中产生的病毒颗粒而发生。不能排除以形成合胞体的方式进行传播，并且这种传播在LRT感染中可能起次要作用。通常，RSV病理始于URT；侵入部位是鼻，少部分经过眼而不是口。当限于URT组织时，尽管在成人中有时是急性的，该疾病限于普通感冒。然而，当病毒到达LRT时，在无保护的个体中会发生细支气管炎和肺炎。在幼婴中，这可危及生命，大约1/100需要住院和机械通气，在这些幼婴中超过1％会死亡。在老年人中，RSV诱发的LRT疾病是住院的主要因素；怀疑RSV导致25％的流感样疾病。对RSV的免疫应答是复杂的。通常，接触h-RSV可建立抗LRT疾病的保护性应答。该应答随年龄增加而减弱，导致老年人群对RSV的更高敏感性。针对URT疾病的长效持久保护表明是不可行的；甚至在同一季节中再次感染很常见，这并不是由于病毒变异引起的。抗RSV感染的保护包括可预防LRT疾病的、针对血液中循环的病毒蛋白质F和G的抗体。通过抗F和G的粘膜抗体可控制URT感染，但这些抗体的寿命有限。需要针对迄今尚未得到鉴定的病毒蛋白质的CD8+T细胞，来清除受感染组织的病毒，但是看来它们的存活时间过短或不能从其储备库中高效募集。更可能的是，这可能是由G基因中编码的RSV表达的因子引起的(Srikiatkhachom，1997a)。RSV疾病的重要方面是病理学免疫增强作用。在有限的病例中，通过从过量吸引的粒细胞释放的细胞因子对感染组织的作用，细胞免疫应答可加重RSV疾病。该反应涉及宿主易患病的体质，但也可能涉及出生后首次RSV感染的时机。不幸的是，用福尔马林灭活RSV的早期免疫试验显示在这些接种情况中，免疫普遍加剧了对野生型(wt)病毒感染的病理(Kim 1969)。RSV中含有的因子是造成该现象的原因，且它显然是由福尔马林处理而释放的。此后的40年中，逐渐表明病毒G蛋白是这些问题的主要介质，但仍旧不清楚机理(Srikiatkhachorn 1997b)。无论如何，使用超出病毒体范围的G蛋白进行接种(即在灭活病毒制剂中，作为没有完全包被在膜中或肽结构中的表达产物)，看起来在模型体系中可导致免疫增强。因此，尽管G蛋白在某种程度上有利于RSV免疫力，它的性质也使疫苗设计变得复杂。最初候选的活RSV疫苗包括冷传代型或温度敏感型突变体。前者通过在不断降低的温度中培养而被减毒，导致依赖于低温进行生长，而后者突变体通过化学或放射诱发突变被制成依赖于特定的、通常是高温进行复制。这些候选的活疫苗呈现出减毒不足或减毒过度(Crowe 1998)。作为中和抗体的主要目标，可从RSV-F或G蛋白衍生候选的亚单位疫苗。候选的亚单位疫苗PFP2(纯化的F蛋白)对RSV血清反应阳性病人是安全的，但不能提供针对LRT感染和相关病症的完全保护(Gonzalez2000)。另一亚单位疫苗是由多肽组成的BBG2Na，其包含融合到链球菌G蛋白的白蛋白结合结构域的h-RSV-G的氨基酸130-230(Power 1997)。BBG2Na在新生小鼠中诱导2型T辅助细胞的应答，并不引发肺的免疫病理(Siegrist 1999)。但还没有有关保护作用的数据。目前在动物模型中研究用于平衡体液和细胞免疫应答的新佐剂的用途(Plotnicky，2003)。在动物模型中已经研究了编码RSV-F和G抗原作为候选疫苗的质粒-DNA载体的用途。这些疫苗在啮齿动物中诱导保护性应答(Li，2000)，不过，在一种啮齿动物中用野生型病毒攻击后，发现RSV-F DNA候选疫苗的免疫小鼠可产生轻度增强的肺部炎性应答(Bembridge 2000)。在人体中使用质粒DNA疫苗的可行性还不得而知，并且在充分研究了并更重要地是接受该方法(特别是婴儿)之前将至少花费15年。由表达RSV蛋白的活重组载体构建基于载体输送系统的候选疫苗。例如，表达RSV-F和G的重组牛痘病毒可在小鼠中提供保护，但在黑猩猩中缺乏该效果(Collins 1990)。问题是根据在人群和婴儿的主目标群中存在的(母体)抗痘病毒抗体，这些系统是否是安全(特别是牛痘病毒)和可行的。一些候选疫苗是基于通过反求遗传学产生的重组活RSV。研究的一个方向集中在通过将造成冷适应和温度敏感的单个或组合突变体导入重组病毒中，来减毒这些病毒。由于减毒过度或减毒不足，这些候选疫苗没有一个是可用的。研究的另一方向集中在缺失一个或多个病毒非结构基因。现在仅有有限的关于这些病毒在模型系统中性质的资料(Jin2003)。对于研制RSV疫苗的可选择的方法是使用牛RSV。只具有人F蛋白或具有人F和G蛋白的嵌合牛RSV，被用于评价其在黑猩猩中的效率。该候选疫苗的复制有限，其程度不能保护动物抵抗野生型h-RSV攻击(Buchholtz 2000)。因此，目前本领域中没有有效可用的h-RSV疫苗。所有已在动物中测试过的RSV候选疫苗不能用于人。因此，在本领域中存在有效、安全的RSV疫苗的长期需求，而本专利技术的目的正是提供此类疫苗。专利技术描述定义在本文及其权利要求中，动词“包含(包括)”及其变化形式用于它的非限制性意义，来表示该词后所纳入的项目，但不排除没有特别提到的项目。另外，不定冠词“一个(种)”所涉及的要素不排除存在多于一个(种)要素的可能，除非上下文清楚本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种包含病毒基因组的肺病毒的病毒体，其中所述的病毒基因组在编码肺病毒感染性所必需的蛋白质的基因中存在突变，其中该突变导致仅由该病毒基因组产生的病毒缺乏感染性，并且其中该病毒体包含病毒体感染性所需形式和量的所述蛋白质。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：威廉卢伊特杰斯，迈拉努尔利维佐约阿特莫佐，
申请(专利权)人：由卫生福利和体育大臣代表的荷兰王国，
类型：发明
国别省市：NL[荷兰]