NF-KB信号通路的重要调控蛋白ChK2制造技术

公开了一种突变型的Ｃｈｋ２蛋白，其具有ＳＥＱ　　ＩＤ　　ＮＯ：２的氨基酸序列，其中２４９位的赖氨酸突变为丙氨酸；还公开了该突变型ＣｈＫ２蛋白作为ＮＦ－κＢ通道抑制剂的用途。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及分子生物学领域，特别是一种突变的ChK2蛋白及其作为NF-KB信号通路抑制剂的用途。
技术介绍
“高质量”的药物靶点基因(简称药靶)是新药开发的源头。人类基因组计划的完成虽然为人类带来了治疗疾病的令人向往的前景，但除大分子蛋白药外，基因本身并不一定是药靶。从基因到新药，这一链条仍然缺少许多必不可少的环节。其中，基因功能研究，因其可以在分子层面上揭示人类健康和疾病的奥秘，寻找出最重要的致病基因，而成为确定基因能否成为药靶的关键步骤。国外大型制药厂已发现，单靠基因序列数据和生物信息分析虽然能够找到大量潜在药物靶点基因，但这类基因只能被归类为“低质量”药靶。药物开发人员面对数目巨大的低质量药靶变得无所适从，迫切需要大量的基因功能研究加以验证，才能筛选出新药开发可以依赖的“高质量”靶点。所以，功能基因组学研究蕴藏着巨大的应用价值和商业前景。在目前可以作为靶点的5,000个基因中，磷酸激酶(kinase)的序列有很大的保守性，是公认的药物筛选基因靶点。蛋白质的磷酸化-去磷酸化是细胞信号转导过程中的重要环节。细胞信号转导是指细胞通过位于胞膜或胞内的受体，感受细胞外信息分子的刺激，经复杂的细胞内信号转导系统的转换，发挥生物学效应，进而几乎调节着生命活动的所有过程，包括细胞的增殖、发育和分化，神经活动，肌肉收缩，新陈代谢，肿瘤发生等。人类很多疾病都与信号转导通路密切相关，如在肿瘤坏死因子(TNF)导致的炎症反应中，肿瘤坏死因子通过结合受体激活一系列蛋白磷酸激酶之间的相互作用，最终激活NF-κB而引起炎症反应。生物化学家以及不少公司都在通过研究蛋白之间的相互作用来揭示信号传递通路的关键部位，并开发影响信号传递的药物，以达到治疗疾病的目的。信号转导过程的顺利进行有赖于多种蛋白底物的磷酸化，包括酪氨酸磷酸化、苏氨酸残基磷酸化及丝氨酸残基磷酸化，而这个过程正是由磷酸激酶催化完成的。Chk2是一个典型的激酶。它含有543个氨基酸，蛋白分子量近61KDa。该基因位于人体染色体22q12.1，于1998年被发现后，它的功能已被日益瞩目。Chk2蛋白主要含有以下几个功能域1)SQ/TQ富集区，该区域主要是含有多个潜在的被磷酸化的位点；2)分叉头结构域，是一个和其他磷酸化蛋白相互作用的区域；3)激酶活性区域。当细胞受到紫外线等刺激使细胞的DNA受到损伤时，Chk2被ATM所磷酸化，在DNA修复过程中调控其下游的一些细胞周期相关蛋白(已知的有CDC25，p53等)，从而将细胞阻滞在某一特定的周期，抑制细胞的增殖，进而抑制肿瘤的形成。而一旦DNA不能被修复，则Chk2将激活凋亡机制，使受损细胞凋亡。Chk2基因的突变会导致Li-Fraumeni综合征，乳腺癌和骨肉瘤等一系列疾病。其中最常见的是1100delC，该突变是一种先天性遗传疾病，这一突变体使Chk2的激酶活性不再存在。据统计，含有该CHK2突变体的女性病人的乳腺癌的几率是正常的两倍，男性是正常体的十倍。在NF-κB信号转导通路中，IL-1或TNF-α等细胞因子，通过一系列连锁反应，激活IKK，IKK又最终激活IκB，磷酸化了的IκB经过泛素化被降解，从而使NF-κB进入细胞核，使NF-κB调控的转录活性增强。因此，IKK的活性化是这一通路非常关键的步骤。作为IKK的上游基因，TAK1已被发现是NF-κB信号通路的一个枢轴基因。TAK1不仅已被证明能够磷酸IKK，而且通过RNA干扰技术，敲除了TAK1后对IL-1或TNF-α所调控的NF-κB通路的影响也已被证实。因此，它是TNF和IL-1所激活的IKK通路中必不可少的重要基因。通过对IL-1激活通路的深入研究，发现当有细胞因子IL-1的刺激时，TAK1在一个连接物蛋白TAB2的帮助下，与TRAF6蛋白相结合。TRAF6的泛素化使TAK1被激活，进一步激活IKK，使NF-κB信号转导通路活化。但是在TNF-α所介导的NF-κB信号转导通路中，TAK1是如何被TNF-α所激活的，它的上游有些什么蛋白参与这一通路，迄今为止都是未知的。因此，目前对于了解NF-κB通路的调控机制，和开发能够抑制该通路的药物有迫切的需要。
技术实现思路
出于上述目的，本专利技术人基于CHK2能够和NF-κB通路的TAK1基因相互作用这一发现，开发了一种突变的CHK2蛋白，它能够和TAK1形成非磷酸化的、从而没有活性的结合物，从而对于NF-κB通路起到抑制作用。因此，本专利技术的一个方面提供了一种突变的CHK2蛋白，其具有SEQ ID NO2的氨基酸序列，在第249位有赖氨酸变为丙氨酸的突变。优选的是该蛋白是由SEQID NO1的核苷酸序列编码的。本专利技术的另一个方面提供了该突变的CHK2蛋白的用途，其可用于制备治疗与NF-κB通路有关的疾病的药物。优选该疾病选自炎症和肿瘤。更优选的，突变型ChK2蛋白抑制TAK1的磷酸化。本专利技术的还有一个方面提供了一种药物组合物，它含有安全有效量的上述蛋白质以及药学上可接受的载体。附图说明图1是Chk2野生型(WT)及其ATP结合位点突变型(K249A)构建至哺乳动物表达载体，转染293T细胞后，用载体自带的tag抗体鉴定其蛋白表达所显示的蛋白质印迹结果。可以看到Chk2及其突变型蛋白表达良好。图2是实施例4的野生型和突变型ChK2和空载体在细胞中与NFkB-luc基因共转染后的相对荧光素酶单位图，结果表明Chk2对NFkB的转录活性激活了8倍以上，而它的活性突变型Chk2Mut(K249A)却没有同样作用，与空载体相比，Chk2突变型反而抑制了NFkB的转录活性。其中“mock”表示空载体。具体实施例方式本专利技术发现磷酸激酶Chk2对NF-kB的信号转导通路是重要的，主要在于与枢纽蛋白-TAK1具有直接相互作用，并且发现Chk2能够激活NF-kB的信号转导通路，它对NF-kB通路的影响受其激酶活性所依赖。综合已有的文献报道，这一结果提示，Chk2很有可能是TAK1的上游调控基因，通过它对TAK1的磷酸化，激活TAK1，从而进一步激活IKK的活性，并引起NF-kB信号转导通路的活化。因此我们的发现为证明Chk2不仅在肿瘤方面，在免疫疾病方面可能成为一个重要的靶点基因提供了进一步的理论依据。为了解明Chk2对NF-κB信号转导通路的调节机制，我们采用自己开发的酵母双杂交技术，以Chk2为诱饵，筛选Hela细胞、淋巴细胞、胎脑组织cDNA文库，希望筛选到一个与Chk2相互作用并且与NFκB信号转导通路的调节相关的蛋白。从而首次发现了TAK1与Chk2的相互作用。为了更进一步明确Chk2的功能及其机制，我们将Chk2克隆至哺乳动物表达载体，在293T细胞进行转染，检测了Chk2蛋白对包括NF-kB在内的一系列转导通路的影响，同时开发了其活性突变型(K249A)作为对照，发现Chk2能够激活NF-κB信号通路，而Chk2的活性突变型则对NF-κB信号通路有竞争性抑制作用。Chk2的这一功能迄今为止还未被报道过。综上所述，本专利技术人通过对Chk2的研究，发现了Chk2能够影响NF-κB信号通路，并且它对NF-κB通路的影响受其激酶活性所依赖。并发现了ChK2主要通过NF-κB通路的相关蛋白-TAK1对该通路起到激活作用。这一本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种突变型ＣｈＫ２蛋白，其特征在于，具有ＳＥＱＩＤＮＯ：２的氨基酸序列，其中２４９位的赖氨酸突变为丙氨酸。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：束放，孙筱清，吴骏，罗楹，
申请(专利权)人：上海睿星基因技术有限公司，
类型：发明
国别省市：31[中国|上海]