用于生产肉毒毒素的肉毒梭菌细菌的培养和发酵的不含动物产物（ＡＰＦ）的培养基和方法。所获得的肉毒毒素可用于配制和组合肉毒毒素药物组合物。ＡＰＦ培养基可包括具有显著降低的水平的肉类或乳品副产物，并使用非动物源性产物替代动物源性产物。优选地，所使用的ＡＰＦ培养基基本上不含或不含动物源性产物。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】交叉引用本申请是2003年9月25日提交的系列号为10/672,876的美国专利申请的部分继续申请，其全部内容通过引用的方式纳入本说明书。
技术介绍
本专利技术涉及获得生物活性的肉毒毒素的培养基和方法。具体而言，本专利技术涉及生物体例如肉毒梭菌(Clostridium botulinum)细菌的基本上不含动物产物的培养基、培养物和厌氧发酵方法，以获得大量生物活性的肉毒毒素。适用于因治疗、诊断、研究或美容的目的而给予人或动物的药物组合物可包括活性成分。该药物组合物还可包括一种或多种赋形剂、缓冲液、载体、稳定剂、防腐剂和/或填充剂。药物组合物中的活性成分可为生物学成分，例如肉毒毒素。用于制备肉毒毒素的药物组合物的肉毒毒素活性成分可通过多步的培养、发酵和组合的方法获得，该方法利用了一种或多种动物源性产物(例如用于获得原料肉毒毒素的一种或多种培养和发酵培养基中的肉汤和酪蛋白成分，和最终组合的肉毒毒素药物组合物中的血液组分或血源性赋形剂)。给予患者含有利用动物源性产物的方法得到的生物活性组分的药物组合物，可使患者具有接受摄入各种病原体或感染性制剂的潜在危险。例如药物组合物中可含有朊病毒。朊病毒是一种蛋白感染性颗粒，推测它来自产生正常蛋白的相同的核酸序列，作为异常构象的同种型而产生。进一步推测在翻译后水平的由正常同种型蛋白到朊病毒蛋白同种型的“募集反应”(“recruitmentreaction”)中存在感染性。看起来是正常的内源性细胞蛋白被诱导而错误地折叠成致病性的朊病毒构象。克雅病(Creutzfeldt-Jacob disease)是一种罕见的神经变性病症——人类传染性海绵样脑病，其传染性因子似乎是朊病毒蛋白的一种异常同种型。患克雅病的个体可在六个月内从看上去完全健康的状态恶化为运动不能性缄默症(akinetic mutism)。因此，给予患者含有用动物源性产物获得或组合的生物组分例如肉毒毒素的药物组合物，存在感染朊病毒介导的疾病如克雅病的潜在危险。肉毒毒素梭菌属按照形态学和功能划分有多于127个种。厌氧性的革兰氏阳性细菌肉毒梭菌产生一种多肽性的强神经毒素肉毒毒素，该毒素在人类和动物中引起被称为肉毒中毒的神经麻痹疾病。肉毒梭菌及其芽孢常见于土壤中，该细菌可在家庭式罐头工厂未适当灭菌和封闭的食品容器中生长，这可引发多种情形的肉毒中毒。肉毒中毒作用一般出现于食用了被肉毒梭菌培养物或芽孢感染的食品后18-36小时。肉毒毒素似乎可以不衰减地穿过肠内膜(lining)而攻击周围运动神经元。肉毒毒素中毒的症状可以由行走、吞咽及语言困难发展至呼吸肌麻痹和死亡。A型肉毒毒素是已知对人类致死力最强的天然生物试剂。A型肉毒毒素(纯化的神经毒素复合物)对小鼠的LD50大约是50皮克。以摩尔计算，A型肉毒毒素的致死力比白喉毒素高1.8×109倍、比氰化钠高6×108倍、比眼镜蛇毒素高3×107倍，比霍乱毒素高1.2×107倍。Singh，Critical Aspects of Bacterial Protein Toxins，Neuronal Toxings II，第四章，63-84页，B.R.Singh等编著，Plenum Press，New York(1976)(根据0.05ngBOTOX等于1单位的事实对其中所述A型肉毒毒素的LD50为0.3ng等于1单位进行了校正)。BOTOX是Allergan公司(Irvine，California)市售的A型肉毒毒素纯化神经毒素复合物的商标。将腹膜内注射至每只重18-20克的雌性Swiss Webster小鼠的LD50定义为肉毒毒素的一个单位(U)。也就是说，杀死一群雌性Swiss Webster小鼠的50％的肉毒毒素的量为1个单位的肉毒毒素。鉴定了七种常见的免疫学上有差别的肉毒梭菌神经毒素，它们分别为肉毒神经毒素血清型A、B、C1、D、E、F和G，其中的每一种血清型是用型特异性抗体中和来鉴别的。这些不同血清型的肉毒毒素在感染动物种类和引发麻痹的严重程度和持续时间上不尽相同。例如，用在大鼠体内产生麻痹的水平为量度，测得A型肉毒毒素的效力比B型肉毒毒素强500倍。此外还测得B型肉毒毒素在大约480U/kg的剂量时对灵长类动物是无毒的，该剂量是A型肉毒毒素对灵长类动物的LD50的12倍。肉毒毒素似乎是以高亲和力结合胆碱能运动神经元，还被移位至神经元内并阻断乙酰胆碱的突触前释放。肉毒毒素在临床上，已用于治疗例如以骨骼肌机能亢进为特征的神经肌肉病症。美国食品药品监督管理局(U.S.Food and DrugAdministration)批准了A型肉毒毒素可用于12岁以上患者的自发性睑痉挛、斜视和偏侧颜面痉挛的治疗，颈肌张力障碍(cervical dystonia)的治疗和眉间线(面部)皱纹的治疗。FDA还批准了B型肉毒毒素可用于颈肌张力障碍的治疗。外周注射(即肌内或皮下注射)A型肉毒毒素的临床效果通常出现于在注射后的一周以内，经常出现于注射后几小时以内。单次肌内注射A型肉毒毒素后症状缓解(即肌肉麻痹松弛)的一般持续时间为大约三至六个月。虽然所有血清型的肉毒毒素都能明显抑制在神经肌肉连接处的神经递质乙酰胆碱的释放，但它们是通过影响不同的神经分泌蛋白和/或在这些蛋白的不同位点进行切割起到抑制作用。A型肉毒毒素是一种锌内肽酶，它可特异性水解细胞内与囊泡相关的蛋白SNAP-25的肽键。E型肉毒毒素也切割这个25kDa的突触小体相关蛋白(SNAP-25)，但是与A型肉毒毒素相比，它靶向于该蛋白中的不同氨基酸序列。B、D、F和G型肉毒毒素作用于囊泡相关蛋白(VAMP，也叫小突触泡蛋白)，每种血清型切割该蛋白的不同位点。最后是C1型肉毒毒素，它表现为切割突触融合蛋白和SNAP-25。上述这些作用机制的差异影响了各种血清型肉毒毒素的相对效力和/或作用持续时间。不论是哪种血清型，毒素中毒的分子机制似乎都差不多，都至少包含三个步骤或阶段。在该过程的第一步，毒素通过重链(H链)和细胞表面受体之间的特异性相互作用，结合到靶神经元的突触前膜；每种血清型的肉毒毒素的受体被认为是不同的。H链的羧基端片段Hc似乎对毒素至细胞表面的靶向作用十分重要。在第二步中，毒素穿过中毒细胞的质膜。毒素首先通过受体介导的胞吞作用被细胞吞食，形成含有毒素的内含体。然后毒素从内含体逃脱至细胞的胞质中。上述的最后一步被认为是由H链的氨基端片段HN介导，它引发毒素对大约5.5或更低的pH值的反应——构象改变。已知内含体具有降低内含体内pH值的质子泵。构象改变暴露了毒素内部的疏水性残基，这使得毒素可以将自身埋入内含体膜中。然后毒素穿过内含体膜移位至胞质溶胶中。肉毒毒素活性机制的最后一步似乎涉及连接H链和L链的二硫键的还原。肉毒梭菌和肉毒毒素的全部毒素活性都包含于全毒素的L链中；L链是锌(Zn++)内肽酶，它可选择性地切割蛋白，该蛋白对于包含神经递质的囊泡与原生质膜的胞质膜表面相识别和对接以及囊泡和质膜的融合十分重要。肉毒神经毒素——肉毒毒素B、D、F和G——引起小突触泡蛋白(也叫囊泡相关膜蛋白(VAMP))的降解，小突触泡蛋白是一种突触体膜蛋白。任何一种上述的切割事件都会导致大部分存在于突触囊泡的胞质表面的VAMP被除去。每种毒素特异性地本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种获得生物活性肉毒毒素的方法，包括下述步骤： （ａ）提供一种发酵培养基，所述培养基基本上不含动物源性产物并包括约４－８％（重量）的大豆来源产物； （ｂ）在允许肉毒毒素生产的条件下，在发酵培养基中发酵肉毒梭菌细菌，和； （ｃ）从发酵培养基中回收生物活性肉毒毒素。
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...
【专利技术属性】
技术研发人员：王平，S多诺万，
申请(专利权)人：阿勒根公司，
类型：发明
国别省市：US[美国]
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