本发明专利技术属于分子生物学肿瘤基因治疗用载体领域，涉及一种供外源基因靶向性导入肿瘤局部的非病毒载体的构建与制备，该载体的特征在于同时具有多种肿瘤局部靶向性、核酸结合性和脂质自发重组性。通过构建真核细胞锚定表达载体，将靶向肽、阳离子肽等多种成分锚定表达在肿瘤细胞表面，裂解并提取细胞膜，获得具有核酸结合性和脂质自发重组性的非病毒基因靶向传递载体。本发明专利技术的特点在于，该载体除了具有通过肿瘤新生血管和多种肿瘤细胞靶向性配体将外源基因靶向到肿瘤局部组织的作用，同时通过穿膜肽、吞噬泡释放剂使该载体具有增加外源基因向肿瘤细胞内转运和避免降解的作用。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于分子生物学肿瘤基因治疗用载体领域，涉及一种供外源基因靶向性导入肿瘤局部的非病毒载体的构建与制备。
技术介绍
基因载体是在基因治疗中使用的将外源基因导入机体细胞的传递系统。外源性基因进入靶细胞有3种障碍①细胞膜；②胞浆内的吞噬泡-溶酶体；③细胞核膜。为了通过这几道屏障基因载体的结构一般包括载体骨架、靶向性配体、吞噬泡释放剂和核定位信号肽。首先载体骨架用来承载并保护DNA分子；其次靶向性配体可以与细胞膜受体特异性结合，加强细胞内吞作用，形成吞噬泡，吞噬泡的pH值逐渐下降形成溶酶体，外源基因将在溶酶体中被降解，病毒来源的两性分子肽(amphipathic peptides)是目前常用的一种吞噬泡释放剂，起到帮助基因复合物逃脱吞噬泡进入胞浆，避免溶酶体降解的作用；最后核定位信号肽可帮助目的基因从胞浆转入细胞核，完成整个基因导入过程。如果是癌细胞靶向，外源基因可利用频繁的细胞分裂进入染色体，那么核定位就不重要了。目前研究的基因载体可分为两大类病毒载体和非病毒载体。病毒载体是靠病毒对细胞的天然感染能力将外源基因整合进宿主细胞，具有较高的转染效率，容易获得对外源基因的长时表达。其缺点是生产不便，毒性尤其是免疫源性大，不宜反复使用以及对所携带的外源基因片断的大小有限制等。非病毒载体虽然在转基因效率和获得长时表达方面不如病毒载体，但不存在上述这些缺点，经过修饰改造的新型非病毒载体在安全、有效、靶向等方面均有所突破，因此成为基因治疗载体的研究热点。本项专利技术涉及的非病毒载体系统同时具备了以上几种特征，以求做到安全、有效、靶向几方面。基因治疗的靶向性问题直接影响其安全性和有效性，现在解决的方法通常是对载体进行靶向性配体修饰。肿瘤血管保持着一种不断新生的状态，其表面有与增生有关的分子标志，整个瘤体就是一个新生组织，他依赖新血管为其供应养分、维持代谢。整合素alpha(v)beta3、alpha v beta5在肿瘤的脉管系统内皮细胞过表达，与肿瘤部位促血管新生作用有关，在某些肿瘤细胞表面也高表达，国内外许多研究者早就将它作为肿瘤的靶标进行研究。通过噬菌体展示技术人们找到的RGD肽是αv整合素配体的结合域，用含有RGD的肽作为配体修饰载体，可将基因靶向αv整合素表达的部位。例如在表达整合素的Mewo细胞上，用RGDC四肽修饰的PEI载体比没有修饰的PEI载体基因转染率提高1-2个数量级。又如用RGD肽修饰的脂质体在人的支气管上皮细胞株(16HBE)的基因表达率提高10-200倍。还有研究发现，PEG化的脂质-鱼精蛋白-DNA复合物(LPD-PEG)使得LPD的基因转染率下降，估计是由于PEG链阻碍了粒子与细胞表面的接触所致，但当用RGD-4C肽(CDCRGDCFCG)修饰LPD-PEG后，对表达整合素受体的肿瘤细胞的结合率上调了5-15倍，转染率在MDA-MB-231细胞提高100倍，而对于整合素αvβ3和αvβ5均低表达的Huh7细胞株则未见转染增强。而且转染增强可被游离的RGD肽阻断。肿瘤鼠在体实验也表明合成肽CDCRGDCFC可抑制由整合素alpha v beta 5和alpha v beta3介导的细胞黏附，抑制效果较其只有一条硫化物骨架结构的类似肽至少强20倍，较完全线性的RGD肽抑制效果强近200倍，该合成肽有靶向肿瘤新生血管及肿瘤的作用。在众多血管新生因子中，血管内皮生长因子(VEGF)在肿瘤血管新生中起了至关重要的作用，VEGF主要由肿瘤细胞表达，与血管新生和肿瘤转移有关，有研究表明，在许多实体瘤中，伴随肿瘤细胞VEGF表达的上调，肿瘤血管内皮细胞中VEGF受体的表达也相应上调，VEGF受体在某些扩散了的癌细胞中有表达。而在正常组织中，血管生成处于静止状态，VEGF受体不表达或极低水平表达，因此人们可以将VEGF受体作为肿瘤靶点，将治疗基因靶向性传递到肿瘤血管内皮细胞或某些表达VEGF受体的肿瘤细胞，而不影响正常细胞的生长。由上海肿瘤所国家癌基因及相关基因研究室的研究人员李运民等人按照公认的VEGF-VEGF受体的结合域，加之计算机同源模建设计并合成了两条寡肽GV1和GV2。GV1(CHPIETLVDIFQEYPDEIEYIFKPSPVPLMRP)GV2(PVPTEESNITMQIMRIKPHQGQHIGEMSFLQHNKCE)希望可以将基因靶向传递到肿瘤血管内皮细胞。实验中将GV1或GV2与吞噬泡释放剂HA20连接到多聚赖氨酸或鱼精蛋白这些可以通过静电吸附作用结合DNA的阳离子骨架上，用pSV2-galactosidase(半乳糖苷酶)作为报告基因，体外试验证实外源报告基因转染到牛主动脉弓来源的内皮细胞(ABAE)和人恶性黑色素瘤细胞(A375)后有表达，体内试验显示，外源基因在肿瘤血管内皮细胞以及皮下移植肿瘤细胞的裸鼠的肿瘤细胞有表达，移植物包括人结肠癌细胞(LOVO)、人恶性黑色素瘤细胞(A375)和人肝癌细胞。说明靶向VEGF受体的配体短肽GV1、GV2成功地将外源基因复合物靶向传递到肿瘤血管内皮细胞和多种实体瘤细胞并表达。NG2是可调节的跨膜硫酸软骨素糖蛋白，是鼠人同源的黑色素瘤糖蛋白，也称为高分子量黑色素瘤相关抗原。人类黑色素瘤糖蛋白HMP(humanmelanoma proteoglycan)与之同源。NG2广泛地表达在新生血管的周皮细胞，属于血管基质部分，包括正常发育组织中的新生血管，修复中的粗糙伤口和肿瘤基质中新生血管基质，静止的血管则没有发现。在成年动物，NG2仅局限性地表达在肿瘤细胞和新生肿瘤血管基质部位，而且NG2/HMP广泛的表达在多种不同肿瘤，包括胶质胚细胞瘤、软骨肉瘤、黑色素瘤和某些白血病的细胞上。Michael A等人于1999年通过噬菌体展示技术找到两个有靶向NG2作用的短肽分子，TAASGVRSMH(TAA)和LTLRWVGLMS(LTL)，两肽均能靶向异种移植黑色素瘤小鼠NG2阳性的肿瘤血管基质部位。目前人们认为周皮细胞是通过调节内皮细胞的增生、微血管发生以及稳定毛细血管壁来影响血管发生的。我们认为NG2既表达在多种肿瘤细胞又表达在肿瘤血管周皮细胞，而且只有在肿瘤新生血管内皮细胞间隙变大时，周皮细胞才得以暴露，因此NG2的配体短肽可同时靶向肿瘤细胞和肿瘤新生血管基质，且靶向性较靶向新生血管内皮的配体来说更为特异。EGFR是具有内源洛氨酸激酶活性的受体超家族的成员之一，它广泛的分布在许多细胞类型，包括表皮和间叶来源的细胞，在某些肿瘤细胞过表达。EGFR的激活可增加细胞增殖能力，和运动能力。HA20(GLFEAIAEFIEGGWEGLEG)是一段与流感病毒衣壳蛋白血凝素区N-端同源的两性肽，被合成作为吞噬泡释放寡肽endosome-releasing oligopeptide(EROP)，它对靶向和穿膜过程没有意义，其作用在于对通过形成吞噬小体进入细胞的外源物质进行及时地释放，避免被逐渐形成的溶酶体所降解，起到保护外源基因的作用。刘翔等人通过计算机软件设计了靶向到EGFR的EGF结合域短肽GE7(NPVVGYIGERPQYRDL)，通过化学方法用两肽GE7和HA20分别修饰多聚赖氨酸，然后将修饰过的多聚赖氨酸作为骨架与一定量的DNA混合，通过静电吸本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种用于肿瘤靶向性基因传递的非病毒载体，其特征在于由肿瘤靶向复合体和细胞膜嵌和膜脂共同形成的膜脂颗粒，可作为肿瘤靶向基因治疗的载体。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：于继云，黄悦，刘荷中，阎瑾琦，修冰水，陈兴，宋晓国，刘颖，
申请(专利权)人：中国人民解放军军事医学科学院基础医学研究所，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]
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